ラットの膝下切断モデルと即時的標的筋肉再神経支配

ある研究では、神経損傷および切断に関連する痛みと、神経の再ルート化がその痛みにどのように影響するかを調査しています。切断を行うと、標準的な痛み評価が制限されます。本プロトコルでは、切断後の痛み行動を測定するために、修正および代替テストを用います。

まず、週齢8～10週、体重250～300 gのSprague Dawleyラットを用意します。ウォーミングパッドの電源を入れ、滅菌手術野を準備します。手術に必要なすべての滅菌器具および材料を配置します。

ラットをイソフルラン（導入時4%、維持時1～2%）で麻酔し、腰下部から後肢の全長にわたる領域を剃毛します。手術部位をポビドンヨード消毒液で洗浄し、続いてアルコール綿で拭き取ります。この手順をさらに2回繰り返します。

ツベルクリン用注射器を用いて、メロキシカムを1 kgあたり1 mg皮下注射します。定規を使用して膝関節線に印を付けます。さらに、膝から遠位方向に2 cmと3 cmの地点に、2つの印を付けます。

メスを用いて、膝から遠位に3cmの位置で皮膚を周状に切開します。鈍的および鋭的剥離を行い、皮膚が自由に反転するまで、皮膚を下の筋肉から周状に分離させます。組織層を維持しながら、より深い筋肉層に向けて剥離プロセスを繰り返し、骨まで剥離します。

マーカーを用いて、周切開部位から近位に1 cmの位置に脛骨と腓骨の印を付けます。小型骨剪刀を用いて、印を付けた位置で脛骨と腓骨を切断します。電気焼灼器を用いて出血を制御し、止血を行います。

骨端を観察し、必要に応じて鋭い端を鈍化させるかトリミングします。4-O吸収性編み糸を用いて、脛骨上の筋区画の前縁を近似させ、4〜6本の等間隔の中断縫合で固定します。前後の筋区画を骨の上で揃えて同時に閉鎖し、筋肉のパッドを形成します。

4-O吸収性編み糸を用いた結節縫合により皮膚を側方で閉鎖します。その際、荷重部の断端への配置は避けてください。切開線に沿って皮膚用接着剤を塗布します。大腿骨から後方に約5 mmの位置に、1.5～2 cmの縦方向の臀裂切開を加えます。

鈍的剥離を用いて臀筋とハムストリング筋を分離し、坐骨神経の三叉分岐近位側を露出させます。尾側大腿筋（CFM）の下にある太い分枝とその分枝を含む、近位の運動枝を確認します。ピンセットでCFMを挙上させ、これを切断します。

微小外科用Dumontピンセットを用い、鈍的剥離によって半膜様筋および大腿二頭筋分枝を神経分離します。神経外膜を把持し、曲がった微小外科用スプリング剪刀を用いて縦方向に切開します。その後、神経枝を分離します。

尾側大腿筋枝を温存し、坐骨神経幹の近傍で残りの分枝を切断します。縫合を容易にするため、運動枝を下方に曲げます。曲がったバネ式剪刀を用いて神経外膜を開き、切断して坐骨神経三叉分枝を神経化します。

精密ピンセットを用いて、神経分枝を慎重に分離します。三分叉点から遠位に5〜10 mmの位置で、総腓骨神経、脛骨神経、および腓腹神経の3本の分枝をそれぞれピンセットで把持します。牽引をかけながら、各神経を遠位側で切断し、5〜10 mmのセグメントを切り出します。

10-0ナイロン縫合糸を用いて、まず総会陰神経を半膜様筋に接続して縫合を行います。1本の縫合につき少なくとも3つの結節を作ってください。神経を締め付けすぎたり、折り曲げたりしないよう、緊張のない状態で配置し、急峻な角度がつかないように縫合部位を整えます。

次に、脛骨神経を大腿二頭筋の大枝に、腓腹神経を大腿二頭筋の小枝に接続します。標的筋肉への再神経支配を行わない切断の場合、坐骨神経の分枝を露出させた後、5-Oシルク縫合糸とピンセットを用いて、総腓骨神経、脛骨神経、および腓腹神経を結紮します。この際、結紮によって神経にひだができていることを確認し、4つの正方形結び（スクエアノット）で固定してください。結び目を用いて各神経を近位方向に緩やかに牽引し、結紮部位から遠位に1〜2 mmの位置で切断します。

遠位神経節を10 millimeters切除し、その後、既報の通りに切断術を行います。切開部を閉じた後、切開線に沿って皮膚用接着剤を塗布します。7日間にわたり、傷口の状態、感染の兆候、痛み、または苦痛がないか毎日ラットを観察し、必要に応じてIACUCのガイドラインに従って処置を行ってください。

Von Frey試験により測定された機械的退避閾値は、ベースラインから有意に低下し、切断後の各タイムポイントにおいて低下したままであった。ピン試験では、ベースラインと比較して、時間の経過とともに侵害受容反応が増加する傾向が示された。断端の冷覚過敏は顕著であり、すべてのタイムポイントにおいてベースラインと比較して持続した。

このプロトコルでは、切断の文脈において、さまざまな神経管理戦略を評価することができます。このプロトコルを実施する際の最大の課題は、幅が1mm未満の神経を非外傷的に操作することです。今後の研究では、この手法を拡張してモデルを改善し、幻肢痛を研究するためのより信頼性の高い方法を開発することが期待されます。