in vitro 上皮オルガノイド-T細胞共培養システムを用いた常駐記憶CD8 T細胞分化
2026年2月3日
CD8 T細胞の分化と機能をin vitroで研究するために、CD8 T細胞をマウスから分離し、既存の感染マウス膣上皮オルガノイドと長期共培養することができます。ここではこの過程を説明し、共培養時の常駐記憶T細胞マーカーの獲得状況を評価します。
私たちの研究は、女性生殖管におけるCD8常駐記憶T細胞を調査し、感染症や疾患がその居住性、機能、維持、治療の可能性にどのように影響するかを調べています。既存の手法では、居住記憶T細胞の生存率と表現型安定性が制限されています。このプロトコルは、オルガノイドT細胞カルト培養を通じて組織レジデンシーを誘導することで、スケーラブルなin vitro研究を可能にします。
まず、24ウェルプレートのウェルごとに、膣上皮オルガノイド(VEO)を密度10,000個の密度で20マイクロリットルの基底膜抽出物をプレートします。プレートをインキュベーターに入れ、37度の環境で7〜10日間培養を維持します。共培養の前日に、指定されたウェルから細胞培養培地を吸引し、DPBSでウェルを洗浄します。
DPBSを吸引し、その後、事前に温められた0.25%トリプシンEDTAを600マイクロリットルの井戸に注入します。BSAコーティングされたP1000ピペットを使い、完全に再懸濁して基底膜抽出物を機械的に破壊し、ウェルの内容物をBSAコーティングされた無菌15ミリリット円錐管に移します。次に、円錐形の管を37度の水浴に入れます。
5分後にRPMIに10%FBSを10ミリリットル加えてトリプシン化を抑制します。次にチューブを遠心分離機に入れ、500Gで4度の温度で5分間回転させ、上澄液を捨てます。BSAコーティングされたピペットチップを使い、ペレットをT細胞オルガノイド培養培地または単なるDMEMF 12に100〜300マイクロリットルに再懸浮させます。
血液細胞計で細胞数を数えてください。感染の多数率0.1を達成するために必要なウイルス体積を、総細胞数と既知のウイルス価を用いて計算します。感染対象として選定されたVEOウェルから細胞培養培地を吸引します。
各井戸を500マイクロリットルの預熱済みDPBSで洗い、皿を37度のインキュベーターに5分間入れます。5分後にDPBSを捨てます。感染率0.1を達成するために、十分なウイルス粒子を含むオルガノイド培地500マイクロリットルを加えます。
プレートを37度のインキュベーターに5%二酸化炭素を入れて1時間置き、20〜30分ごとに手で優しく回します。メッキに必要な適切な量の基底膜抽出物を、マイナス80度の貯蔵から4度の貯蔵に移し、8時間解凍します。VEOを光学顕微鏡で確認し、サイズや全体的な健康状態を評価してください。
VEOの直径は約100マイクロメートルで、均一な円形形態と最小限の単一細胞であることを確認しましょう。VEOウェルから細胞培養培地を吸引し、各ウェルに500マイクロリットルの冷たい無菌DPBSを2〜8度で洗浄します。DPBSを除去した後、各井戸に200〜500マイクロリットルの冷たいオルガノイド収穫液を加え、基底膜抽出液の少なくとも10倍の体積を確保します。
その後、BSAコーティングされたP200ピペットを使い、機械的に基底膜抽出物を破壊します。次に、プレートを約100回転毎分、4度の温度で20分間回転させる軌道シェーカーに置きます。インキュベーション後、BSAコーティングされたピペットチップを使って各ウェルの内容物を混ぜ、BSAコーティングされた無菌15ミリリットル円錐形チューブに移します。
チューブを遠心分離機に入れ、500Gで4度の温度で5分間回転させます。その後、上澄液を捨てます。VEOペレットを5〜10ミリリットルの冷たいDPBSで洗浄し、500Gで4度で5分間遠心分離します。
DPBSを吸引し、その後P1000ピペットチップでペレットを1ミリリットルのT細胞オルガノイド培養培地に再懸浮させ、T細胞が共培養の準備が整うまでVEO懸濁液を氷上に置きます。T細胞を採取する際は、光顕微鏡で静止中のT細胞を検査し、サイズと全体的な健康状態を評価してください。T細胞にクラスタリングや拡大した形態、そして細胞の破片や断片が目に見えないことを確認してください。
P1000ピペットを使い、ウェルの各隅で上下にピペットを数回繰り返してTセルを再懸浮させます。円錐形のチューブを集め、生きたCD8 T細胞の総数を数えます。次に、T細胞懸濁液を遠心分離機に入れ、584Gで4度の温度で5分間回転させます。
上清液を廃棄し、T細胞ペレットを10ミリリットルのT細胞オルガノイド培養培地に再懸濁します。その後、事前に準備されたVEOを含む円錐形チューブに適切な数のT細胞を移し、細胞を結合させます。VEOとTセルの混合懸濁液を遠心分離機に入れ、584Gで4度Cで5分間回転させます。
上清液を捨てた後、VEO細胞とT細胞を適切な容量の基底膜抽出物に再懸浮させます。次に別のピペットチップを使って、懸濁液を予備加熱された組織培養板にメッキし、24ウェルプレートに対して1ウェルあたり20マイクロリットルを供給します。次に組織培養プレートを逆さまにして、37度のインキュベーターに置きます。
基底膜の完全な接着と固化には30分ほど待ちます。孵育期間終了後、補足した完全なT細胞オルガノイド培養培地を各ウェルに慎重に加えます。24ウェルプレートなら1ウェルあたり500マイクロリット、96ウェルプレートなら250マイクロリットルを供給し、基底膜抽出液滴を乱さないようにウェルの側面に媒体を加えます。
サンプルがフローサイトメトリー解析のために採取されるまで、培養培地を2日ごとに交換してください。リンパ球性絨毛膜炎ウイルスに感染した生後7日齢のマウスVEOは、共培養後4時間以内に豊富なウイルス複製を示し、オルガノイド内の蛍光信号として確認されました。感染したオルガノイドの近くにCD8 T細胞が蓄積することは、共培養の後の時点で顕著になりました。
CD8 T細胞の進行的な凝集は、感染オルガノイドにおける後の時点における黄色蛍光タンパク質シグナルの目に見える減少と関連していました。感染したVEOsと共培養されたCD8 T細胞では、時間とともにCD 69およびCD 103の発現が増加し、組織常駐記憶表現型の獲得を示しました。抗原刺激CD69陽性、CD103陽性、CD8 T細胞は、非刺激対照群と比較して細胞内インターフェロンガンマおよびインターロキン2産生が有意に増加しました。
このプロトコルにより、CD8の常駐記憶T細胞のin vitro研究が可能となり、動物モデルに依存せずに上皮細胞やT細胞の効率的な操作が可能になります。このプロトコルで最も重要な課題は、生存率や感染が共培養生存率や実験結果を損なう中で、健康で生存可能なT細胞および膣上皮オルガノイドを維持することです。フローサイトメトリクス解析に注力しましたが、共培養は染色、画像診断、シーケンスのために採取可能です。
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概要
このプロトコルは、オルガノイド-T細胞共培養システムを用いてCD8常駐記憶T細胞分化を研究する方法を示しています。これは、制御されたin vitro環境でT細胞反応を調査することを可能にし、女性の生殖器における免疫反応の理解に不可欠です。
主要な研究要素
科学分野
- 免疫学
- 感染生物学
- 細胞培養技術
背景
- CD8 T細胞は免疫反応において重要な役割を果たします。
- 常駐記憶T細胞は長期免疫に不可欠です。
- これらの細胞を研究する既存の方法には限界があります。
- オルガノイドモデルはより生理学的に関連した環境を提供します。
研究目的
- CD8 T細胞分化を研究するためのスケーラブルなin vitroシステムを開発すること。
- 感染がT細胞の常駐性と機能に与える影響を評価すること。
- 常駐記憶T細胞マーカーの獲得を評価すること。
使用方法
- マウスからCD8 T細胞の分離。
- 感染した膣上皮オルガノイドとT細胞の共培養。
- T細胞マーカーを評価するためのフローサイトメトリ解析。
- 時間の経過に伴うウイルス複製とT細胞反応のモニタリング。
主な結果
- オルガノイドの感染はT細胞の蓄積につながります。
- CD8 T細胞は記憶マーカーの発現が増加します。
- 刺激されたT細胞におけるサイトカインの重要な産生。
- この方法により、in vitroでのT細胞の挙動の詳細な研究が可能になります。
結論
- このプロトコルにより、CD8常駐記憶T細胞の効率的な研究が可能になります。
- 感染の文脈におけるT細胞反応に関する洞察を提供します。
- このアプローチにより、T細胞研究における動物モデルへの依存度を減少させる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Modeling CD8 T cell differentiation within a physiologically relevant epithelial organoid system addresses a critical gap in immune target validation for mucosal barrier tissues. This in vitro co-culture platform enables mechanistic de-risking of epithelial-T cell interactions, supporting predictive confidence in early immunology discovery and translational research. The approach offers scalable, reductionist analysis of tissue-resident memory T cell (TRM) biology, directly informing portfolio decisions in immunotherapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of epithelial-derived cues driving CD8 T cell differentiation.
- Supports functional validation of immune targets in a controlled, disease-relevant system.
- Facilitates mechanistic de-risking by isolating variables influencing TRM phenotype acquisition.
- Provides a platform for hypothesis-driven exploration of protective immunity mechanisms.
Screening & Assay Development
- Prepares validated organoid-T cell co-cultures for downstream phenotypic and functional assays.
- Standardizes quantitative flow cytometry and cytokine readouts for reproducible immune profiling.
- Enables scalable screening of modulators affecting T cell residency and function.
- Supports assay development for compound evaluation in a physiologically relevant context.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro findings with disease-relevant mucosal tissue biology for translational continuity.
- Enables risk-adjusted advancement of immune targets by modeling infection-driven T cell responses.
- Supports biomarker discovery through quantitative analysis of TRM-associated markers and cytokines.
- Facilitates preclinical decision-making by providing mechanistic insights into tissue-specific immunity.
Pipeline & Workflow Integration
This co-culture system bridges early discovery and preclinical research by enabling hypothesis testing, pathway clarification, and functional immune target validation in a scalable in vitro format.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of epithelial signals in TRM differentiation.
- Screening: Provides reproducible, quantitative outputs for immune phenotyping and cytokine analysis.
- Analytics: Delivers flow cytometry and ELISA-compatible readouts for comparative condition analysis.
- Translational Research: Models infection-driven immune responses in barrier tissues for preclinical alignment.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform adaptable to diverse epithelial and T cell sources.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in immune target validation.
- Operational Value: Standardizes co-culture and analytical workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by enabling early de-risking of immune targets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of immunotherapeutic candidates.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, T cell isolation, and co-culture techniques.
- Demands access to flow cytometry, imaging, and ELISA infrastructure for quantitative analysis.
- Necessitates cross-team standardization of cell viability and infection protocols.
- Adaptable to other epithelial and T cell sources with protocol optimization.
- Dependent on maintaining high viability of both organoids and T cells for reliable outputs.
