肺線維症の再現可能かつ低侵襲マウスモデルのための洗練されたエアロゾルを用いた気管内ブレオマイシン投与法

肺線維症の誘発と前臨床薬剤評価の改善を目的とした再現性のある低侵襲エアロゾルベースの薬物送達モデルの開発を目指しています。本モデルは、手術外傷を減らし、実験間での再現性を向上させると同時に、一貫した信頼性の高い薬物投与を可能にします。このモデルを肺線維症および臨床的な肺損傷に対する独自の治療法の試験に適用する予定です。

まず、滅菌1ミリリットルの注射器を使い、滅菌0.9%塩化ナトリウムを3ミリリットル抽出し、塩化ナトリウムを15単位のブレオマイシン塩酸塩入りバイアルに注入します。バイアルを優しく回してブレオマイシン粉末が完全に溶けるまで使い、5単位/ミリリットルのストック溶液になります。ストック溶液を無菌の1.5ミリットルマイクロ遠心分離機チューブに分割します。

次に、3.75単位/ミリリットルおよび2.5単位/ミリリットルの作業溶液を無菌生理食塩水で希釈して準備します。ネブライジング針、ネブライジングシリンジ、投与柱がすべて揃っているようにエアロゾル投与装置を準備してください。エアロゾル投与注射器を無菌生理食塩水に浸します。

ゆっくりと液体を吸引し、8秒間休憩してから素早く液体を排出します。最終排出後は無菌生理食塩水で注射器を補充します。エアロゾライジングニードルを装着し、接合部に生理食塩水が満たされていることを確認してください。

次に、完全に組み立てられた針を滅菌生理食塩水に浸します。ブレオマイシン作用液でエアロゾライジ針をプライムするには、各サイクルの間に8秒間を挟み、3回吸引して排出します。ブレオマイシン作用のある溶液を吸引して注射器に入れます。

50マイクロリットルのピラーの上に25マイクロリットルの投与ピラーを挿入し、総体積を校正します。余分な溶液は排出してください。その後、麻酔されたマウスを挿管プラットフォームに置きます。

上の切歯をワイヤーループにフックし、四肢をテープで固定してマウスを安定させます。湾曲した鉗子を使って、舌を優しく引き抜きます。小動物の喉頭鏡を挿入して声門を視覚化し露出させます。

次に露出した声門にエアロゾライジング針を垂直に挿入し、ブレオマイシンエアロゾルを迅速に気管内に送り込みます。その後、マウスを温めパッドの上に置いて体温を保ちます。マウスが完全に麻酔から回復するまで継続的に観察してください。

指をつまんで反射を確認し、ネズミが生きているか確認します。ヘマトキシリンおよびエオシン染色により、5単位/kgのブレオマイシン群において軽度の肺胞壁の肥厚と局所的な線維化が認められました。一方、7.5単位/キログラム群では広範な肺胞崩壊と重度の線維化病変が見られました。

修正アシュクロフトスコア定量化では、ブレオマイシン処理マウスで生理食塩水対照群と比較して線維化の重症度が用量依存的に増加することが示されました。マッソンのトリクロム染色により、5単位/キログラム群のコラーゲン沈着増加と7.5単位/キログラム群の広範な間質性線維化が明らかになりました。コラーゲン陽性領域の定量化により、ブレオマイシン治療後にコラーゲン沈着が用量依存的に有意に増加することが確認されました。

免疫組織化学的染色により、両方のブレオマイシン群の肺でCol1A1タンパク質の発現が増加し、7.5単位/キログラム群ではより強く広範囲に染色が観察されました。ヒドロキシプロリン含有量は両ブレオマイシン処理群で有意に高く、肺組織におけるコラーゲン蓄積の増加が確認されました。静的肺の遵守は、ブレオマイシン治療群で用量依存的に有意に低下しました。

吸気容量は生理食塩水と比べて7.5単位/キログラムのブレオマイシン群でのみ有意に低かった。呼吸器系のエラスチンは、7.5単位/キログラム群で生理食塩水と比べて有意に増加しました。呼吸器系の遵守率は7.5単位/キログラム群でのみ有意に低下しました。