イムノブロッティングによるアフリカ ツメガエル 卵母細胞および胚からのタンパク質の最適化分析

動物の生涯を通じて、硫酸塩の決定が継続的に発生し、正常な発達と成体の健康を可能にします。これらの決定は、硫酸塩調節因子と呼ばれる特定のタンパク質に依存します。私たちの研究の目標は、これらの重要な調節因子の合成を制御するメカニズムを見つけることです。

免疫ブロッティングとアフリカツメガエルの卵母細胞と胚の詳細な概要を提供することに加えて、私たちのプロトコルは、抗体の調達など、このモデル生物に共通する課題についての洞察を提供します。私たちの研究は、両尾Cの結合および抑制メカニズムの詳細な研究を通じて、他のトランスレーショナルレギュレーターを比較するための情報の基盤を確立するのに役立ちました。イムノブロッティング用の細胞処理を開始するには、胚または卵母細胞ごとに2倍の脱イオン水で1倍の濃度に希釈した10マイクロリットルのチルド細胞溶解バッファーを加えます。

マイクロペストルを使用して、氷上でサンプルを均質化します。チューブを卓上遠心分離機に入れ、サンプルを摂氏4度で5, 000 gで10分間回転させて、卵黄や不溶性色素などの破片をペレット化します。上清を清潔な 1.5 ミリリットルのチューブに移し、移送中にペレットが乱されないようにします。

5重量比2-メルカプトエタノールを添加した2倍のLaemmliサンプルバッファーを、収集した上清に等量に加えます。混合物を摂氏95〜100度で10分間加熱して、タンパク質を変性させます。次に、4〜12%のビストリスSDSプレキャストゲルをパッケージから取り出し、ゲルの底からステッカーをはがします。

ゲルをバッファーダムの反対側の電極アセンブリに挿入し、アセンブリ全体を垂直電気泳動タンクに入れます。次に、電極アセンブリとタンクの底の両方にTris-MOPS-SDSランニングバッファーを充填します。ゲルコームとピペットのランニングバッファーをウェルにそっと取り出し、気泡を除去し、バッファーを平衡化します。

次に、5マイクロリットルの染色済みタンパク質標準試料を最初のウェルにロードし、調製した各サンプル10マイクロリットルを残りのウェルにロードします。電気泳動タンクに蓋をし、電源に接続します。次に、電圧を 200 ボルトに設定して電気泳動を開始します。

サンプルバッファー色素の前面がゲルから出たら電気泳動を停止します。電気泳動が完了する前に、トランスファー クリップにトランスファー サンドイッチの組み立てを開始します。ガラス製のグラタン皿に冷やした転写バッファーを入れ、組み立て中にすべての転写材料をこのバッファーに浸します。

黒い半分を底に置き、白い半分を上に向けて、クリップを左に開いた状態で、転写クリップを皿に置きます。転写クリップの黒い半分に1つまたは2つのファイバースポンジを平らに置きます。0.35ミリメートルのセルロースクロマトグラフィー紙を2枚サイズにカットした後、スポンジの上に1枚を置きます。

電気泳動が完了したら、電気泳動タンクからゲルを取り出します。ゲルカセット開閉レバーを使用して、ゲルが片側に付着したままになっていることを確認しながら、ゲルプレートを慎重にこじ開けます。ゲルリリーサーを使用して、ゲルの上部からウェルを切り取ります。

プラスチックカセットの半分に取り付けたままのゲルをろ紙の上に置き、残りのカセットの半分を取り外して、ゲルが紙の上に平らに保たれるようにします。次に、ゲルの寸法に合わせて0.45マイクロメートルのニトロセルロース膜を切断します。保護紙からメンブレンを取り除き、転写バッファーで短時間濡らし、慎重にゲルの上に置きます。

次に、ニトロセルロース膜の上に2枚目のろ紙を置きます。ローラーを使用して、すべての気泡を優しく、しかししっかりと押し出します。濾紙の上にさらに1つまたは2つのファイバースポンジを積み重ねて、サンドイッチを完成させます。

転写カセットを閉じてしっかりとクリップし、組み立てたサンドイッチを密閉します。次に、閉じた転写サンドイッチをクリップを上に向けて転写コアに挿入し、クリップの黒い面がコアの黒い面を向くようにします。トランスファーコアを電気泳動タンクに入れます。

アイスパックと撹拌バーをタンクに追加し、撹拌バーが自由に回転できるようにします。装置が完全に水没するまでタンクに冷やした移送バッファーを入れ、蓋を上に固定します。装置を電源に接続し、電極の色を合わせ、撹拌バーを回転させながら1時間100ボルトに条件を設定します。

移送が完了したら、慎重にカセットを開け、サンドイッチを分解します。ニトロセルロース膜を取り外し、ゲルと接触していた面に印を付けます。次に、ニトロセルロース膜を小さな容器に入れ、底に対して平らに置きます。

メンブレンをポンソーの染みで完全に覆い、ロッカーの上で5〜10分間軽く揺らします。ポンソー染色を注いだ後、余分な染色が除去され、レーンにタンパク質バンドが見えるようになるまで、二重脱イオン水でメンブレンを数回すすぎます。次に、図のようにメンブレンブロッキング、抗体インキュベーション、洗浄ステップを実行します。

二次抗体のインキュベーションと洗浄が完了すると、メンブレンをイメージングする準備が整います。暗い部屋で、現像液の電源を入れ、温めます。膜を完全に覆うのに十分な大きさのラップを2つの正方形に切ります。

鉗子を使用して、ニトロセルロース膜をラップの最初の正方形の上に表向きに置きます。1.5ミリリットルのチューブに、同量の化学発光ルミノールとエンハンサー試薬を混合します。次に、約1ミリリットルの混合物を使用して、ほとんどの膜を覆います。

ラップを使用して、膜を優しく操作して表面全体が均一にコーティングされていることを確認し、1分間インキュベートします。次に、鉗子で膜をつかみ、液体を軽く振り落とすことで、余分なECL試薬を取り除きます。メンブレンを2番目の正方形のラップの上に上向きに置き、メンブレンの上にゆるく折りたたんで、ラップをオートラジオグラフィーカセットにしっかりとテープで留めます。

次に、示されている手順に従って、暗い部屋でオートラジオグラフィーフィルムを使用して膜を画像化します。所望のタンパク質の可視化が達成されたら、現像フィルムを暗闇で光るマーカーに合わせ、それらをガイドとして使用して、事前に染色されたタンパク質標準の位置をフィルム上にマークします。イメージングが完了したら、ラップからメンブレンを慎重に取り除き、TBSTWに浸して残留ECL試薬を洗い流します。

膜のポンソー染色により、タンパク質転移の成功が確認されました。内因性B1タンパク質は卵母細胞サンプルでは検出されませんでしたが、ステージ7およびステージ10.5の胚サンプルでは約107キロダルトンで明確に検出されました。Bicc1抗体を使用して、すべての段階で注入されたサンプルで70キロダルトンの小さなタンパク質バンドが検出され、HA-Bicc1 C末端融合の発現が成功したことが示されました。

HA抗体は、注入されたサンプルでのみ同じ70キロダルトンバンドを検出し、融合タンパク質に対するBicc1抗体の特異性を確認しました。CNOT1抗体を使用して、約250キロダルトンと270キロダルトンの2つの高分子量バンドがすべてのサンプルで検出されました。54キロダルトンDDX6タンパク質の発現はすべてのサンプルで検出されましたが、ステージ10.5の胚では目に見えて減少しました。