デジタル空間プロファイリングのための形態学およびRNA保存された石灰化動脈の準備・処理

空間トランスクリプトミクスは、単細胞RNAセクシーやバルクRNAセクシングに比べて、組織内の空間情報を保持する利点を提供します。RNAscope、計算的反畳み込み、公開されている単一細胞データセットなどのツールを用いることで、細胞の挙動をニッチや遺伝子プロファイルにマッピングし、組織生物学の統合的なビューを構築することが可能です。この技術は爆発的に進歩している。

2025年5月のNature誌の2本の論文は空間転写体学の研究に焦点を当てています。PubMedをチャート化すると、その曲線はさらに急で、2023年には約150本、2024年にはほぼ300本、そして2025年には500本を超えるペースです。空間トランスクリプトミクスは、がん生物学、神経科学、免疫学、発生生物学など、いくつかの主要な研究分野をすでに変革しています。

しかし、血管生物学は遅れています。動脈や静脈の異質性と独特な形状は、組織の付着やRNA保存に困難を生み出しています。さらに、進行した血管病変には石灰化や血栓症が伴い、組織の完全性がさらに低下します。

このプロトコルは特に器状構造向けに設計されています。また、RNA、カルシウム沈着、関心細胞の評価に必要な染色処理とコスト削減の方法論も含めています。他分野と比べて血管に焦点を当てた空間トランスクリプトミクス研究が現在希少であることを踏まえ、このプロトコルはコスト効率が高く初心者にも優しい設計をしており、血管研究者が空間トランスクリプトミクスを研究に導入するためのアクセスしやすいツールを提供します。

このプロトコルは、臨床実験のための大規模なコホートサンプルにも有効である可能性があります。本プロトコルでは、石灰化した動脈組織の慎重な取り扱い、RNAの質と組織形態を保存するための石灰化特性法、ROI選択時の検証と指導のための染色技術、そして準備済みスライド上の最終形態マーカー染色を詳細に説明し、デジタル空間プロファイラー機器での処理準備が整うようにします。前脛骨動脈、後脛骨動脈、会陰動脈を含むヒト脛骨動脈は、患者の切断検体から採取され、1%HEPESおよび1%ペンストレプを含むDMEMに保存されました。

各動脈は培地とともに100ミリのペトリ皿に移されます。過剰な血管周囲結合組織は無菌ハサミと鉗子を用いて除去され、動脈壁のみが残ります。切除した動脈は新しい培養皿に移されます。

皿の中に無菌まな板が用意されます。動脈は外科用刃で1センチメートルの区間に切り開かれます。各動脈の2区間は液体窒素のクライオチューブでスナップ冷凍され、将来のタンパク質やRNA研究のために凍結保存されます。

残りのセグメントは10%中性の緩衝ホルマリンを含む15ミリリットルのチューブに入れられ、4度の温度で24〜48時間固定されます。RNA安定化溶液中の10%EDTA脱鈣溶液を準備し、pHを作動溶液の5.2に調整します。固定されたティッシュはPBSを含む新しい皿に移し、短時間洗浄されます。

各サンプルは脱灰剤を含む15ミリリットルのチューブに移され、4度Cで72時間攪拌されます。脱石除去が完了した後、PBSで5分間優しく攪拌しながらサンプルを2回洗浄します。組織はカセットに転写されます。

カセットはティッシュプロセッサーに入れられます。ホルマリンの処理は少なくとも4時間行われます。この時間はサンプル行列によって変動します。

複数の動脈区間が各ブロックに設置されます。ブロックはパラフィンで満たされ、完全に冷ます。スライドは、スライド裏面に組織の制限部分をマークして準備します。

すべてのセグメントがGeoMx DSP機器で求められる制限範囲内にあることを確認します。余分なパラフィンはブロックから切り取られます。ブロックは低プロファイルのブレードで5ミクロンまで断片されます。

ティッシュリボンは指定されたエリア内に取り付けられます。DSP実験では、異なる染色ごとに少なくとも4つの連続セクションがブロックごとに取り付けられています。使用まで4度の温度で保存してください。

次に、RNAscopeのin-situハイブリダイゼーションおよび組織学的染色が連続的に準備されたスライド上で行われます。さらに、別のスライドセットには免疫細胞用のCD45や平滑筋細胞のα-SMAなどの形態的マーカーが施されています。RNAscopeのin-situハイブリダイゼーション手順は、前処理としてのスライドベイキング、標準的な脱硫黄化と再水和、ターゲット回収、シグナル増幅を伴うプローブハイブリダイゼーション、RNA可視化のための染料染色の4つの主要なステップから簡単に構成されます。

組織学的検証のために、カルシウム沈着の正確な位置特定を可能にするためにH&E染色およびアリザリンレッドS染色の両方が行われます。最後に、標準的な免疫組織化学プロトコルを用いて形態学的マーカー染色を行い、関心のある細胞を特定してROI選択を導きます。本研究では、2つのEDTAベースのプロトコルが比較されました。1つは10%EDTA単独で72時間、2つは10%EDTAとRNA安定化溶液を同じ期間使用しました。

形態およびRNAの質はRNAscopeのin-situハイブリダイゼーションで評価されました。両方法とも血管構造は保持されましたが、EDTAおよびRNA安定化溶液カクテルで処理したスライドでは、右パネルに示されているように、RNA安定化液が転写本を保護し、EDTAが結晶リン酸カルシウムをキレートし、RNaseを活性化せずに標本を徐々に軟化させることを示しています。RNA保存戦略を最適化し品質が確認された今、ヘマトキシリンとエオシン、アリザリンレッドSを用いたカルシウム沈着のための組織学的染色手順を示します。アリザリンはイオン性カルシウム塩に選択的に結合し、オレンジ色からブリックレッドへの色相変化を特徴とし、微小および巨クロの石灰化を敏感に強調しますが、H&Eほど細胞外および細胞外のマトリックスの詳細は提供されません。

両方の染色を使うことで構造的および組成の情報が最大化されます。形態マーカー染色後、スライドはGeoMxプラットフォーム上でスキャンされます。抗体CD45は免疫細胞をマークし、一方でアルファ平滑筋アクチンは培地中に豊富な血管平滑筋細胞を標識します。

選ばれたROIは、十分なRNA収量を持つ約100から150の核を含みます。ROIは石灰化部位の隣接および遠隔に配置し、脛骨動脈内側石灰化に関連する空間的遺伝子発現パターンを比較しました。数時間にわたる処理過程で一部の組織損失があったものの、各動脈断片で複数の適切なROIが確認されました。

結論として、このワークフローは空間的トランスクリプトミクス研究のための、検証染色とROI選択を通じた石灰化動脈組織の取り扱いと脱炭素化をカバーします。特に、H&Eとカルシウム特異的アリザリン染色の組み合わせは、血管石灰化の正確な位置を特定し、ROI配置のための構造的および組成情報の両方を最大化します。RNAscope解析により、脱石化した動脈断片は十分なRNAを含み、ほぼ無傷であることが示されています。