マウスの卵巣血管機能のライブイメージングと定量化のためのドップラー超音波検査

本研究は、非侵襲的なin vivo法を用いて尿の排卵前卵巣血流を特徴づけることを目的としています。この分野には、マウスの正常な生理機能を乱さずに卵巣血管の再構築をリアルタイムで研究する非侵襲的な方法が不足しています。まず、イメージングシステムの背面にあるメイン電源を入れます。

システム起動後、カートリッジ左側のコンピュータスタンバイスイッチを切り替えてモニターとコンピュータを起動させます。MS700トランスデューサーを、イメージングユニットの最右端ポートにあるアクティブトランスデューサーポートに接続します。トランスデューサーコネクタのロックピンをポートのノッチに合わせてください。

コネクターを完全に押し込み、ロックレバーを垂直位置に回して固定します。ソフトウェアアイコンをクリックして解析ソフトウェアを起動してください。「新着」をクリックして新しい研究を作成し、ドロップダウンメニューから適切な名前を選択してください。

研究情報ウィンドウで研究名、シリーズ名を入力します。適用パッケージは卵巣、測定パッケージは血管です。プログラムが開かれトランスデューサーが自動的に検出されたら、卵巣の適用パッケージを選択します。

次に、心拍数モニタリングのために適切な接触を確保するために、各電極に少量の電極クリームを塗布します。動物が完全に鎮静されたら、ストップコックをノーズコーンに開けてイメージングプラットフォームに行き、ストップコックを誘導チャンバーに閉じてガスの流れを誘導します。マウスを加熱されたイメージングプラットフォームに優しく移します。

マウスをうつ伏せの姿勢に置き、背側が上向きになり、鼻のコーンを鼻の上に固定して麻酔を維持します。生理的モニタリングのために、電極クリームを塗った足を対応する電極パッドにテープで固定します。麻酔中の角膜乾燥を防ぐために眼科軟膏を塗布してください。

足の指つまみ反射法で十分な麻酔深度を確認してください。動物のバイタルサイン、例えば呼吸数や心拍数、不快感を示す動き、プラットフォームの温度を5分ごとに監視します。次に、電動シェーバーを使って右後肢から正中線まで背骨の右下四分円を剃り、背骨に外側に保ちます。

体毛除去クリームを薄く塗ります。1分後に、湿ったガーゼでクリームをしっかり拭き取ります。その後、剃られた部分にたっぷり均一な超音波ジェルを塗布します。

トランスデューサープローブを機械式スタンド上のマウスに対して横方向に位置し、ノッチはオペレーターの左側を向いています。クランプでプローブを固定してください。コントロールパネルのBモードキーを押すと標準のグレースケールイメージングウィンドウが起動します。

マウスとプラットフォームが平らであること、そしてトランスデューサーが表面に対して垂直であることを確認しましょう。次に、皮膚を左に引き、トランスデューサーを上部の剃られた部分、背中の正中線に近い位置に位置させます。トランスデューサーを超音波ジェルでコーティングした剃った部分に優しく下ろします。

プローブの左端を背骨に、右端を右脇腹の上に合わせます。卵巣を特定するには、まず腎臓を特定します。腎臓は大きな淡い灰色の卵形構造で、皮質と延髄があります。画像プラットフォームをマウスの頭部に少し押し込むと、卵巣と骨膜脂肪組織が現れます。

Cine Storeボタンを押してBモードの動画をキャプチャしてください。今、コントロールパネルのパワードップラーモードのキーを押すと、低速度の流れに敏感な血管を視覚化できます。ドップラーゲインを32〜55デシベル、感度を5、ダイナミックレンジを15 DR、ベビーを1キロヘルツに調整してください。

プラットフォームを優しく前後に動かして、卵巣血管を最もよく見て、卵巣ヒルムに入る卵巣動脈、中央延髄の髄質血管、発達中の卵胞の周囲の皮質血管を特定します。Power Dopplerモードで卵巣と血管の表示映像を保存するには、Cine Storeをクリックしてください。動脈流と静脈流を区別するには、カラードップラーモードを押してください。

赤はトランスデューサー方向の流れを示し、青はトランスデューサーから離れる流れを示します。平均速度が高い血管は卵巣動脈です。パルス波PWドップラーボタンを押すと、サンプルの日付ラインが表示されます。

もう一度押すとドップラースペクトル波形が起動します。サンプルゲートを血管ルーメンの中心に位置させた後、アングルノブを使ってインソネーション角を60度以下、かつ流れに平行に調整します。卵巣動脈の場合は、卵巣に入る直前にゲートを設置してください。

髄質血管の場合は、中央の分岐部に置きます。皮質血管の場合は、成長中の卵胞の基部に置いてください。超音波画像とスペクトル波形の両方を保存するには、Cine Storeを押してください。

画像診断が終わったら、背面の超音波ジェルを拭き取り、マウスを優しく画像プラットフォームから取り除きます。そして、完全に目が覚めるまで温熱パッドの上にマウスを置きます。パワードップラーイメージングにより、ヒト絨毛性ゴナドトロピン注射後1時間で髄質血管内の液量が目に見えて増加し、その後8時間でベースラインに戻り、注射後12時間でさらに減少することが示されました。

カラードップラーイメージングにより、卵巣動脈と卵巣静脈の明確な区別が可能となり、卵巣血管内の流れ方向の可視化が向上しました。代表的なPWドップラー波形は、ホルモン反応性マウスの卵巣動脈で収縮期および拡張末期速度が測定可能な明確な周期を示したのに対し、非反応マウスは検出可能な波形が検出されない低い信号痕跡を示した。ヒト絨毛性ゴナドトロピン注射後1時間後、刺激に反応したマウスでは卵巣動脈、髄質血管、皮質血管の血流速度が増加しましたが、反応しないマウスではそのような増加は観察されませんでした。

反応しないマウスでは、割り当てられたプレースホルダー値で示された特定の時刻点で皮質血管の速度が検出閾値を下回りました。ドップラー超音波を用いて、マウスのDLHサージ後、卵巣の血流速度が急激に増加することを明らかにしました。ドップラー超音波検査は、排卵前期間中の卵巣血行動態を繰り返し非侵襲的に評価することを可能にします。これは他の方法では達成できないことです。

正常な排卵前血行動態を特徴づけた後、今後の研究ではこのプロトコルを用いてPCOSのような卵巣疾患のモデルにおける血流障害を検証できるようになります。