Name: 滴をハンギングShrinky -ディンク：胚の体を形成し、文化に簡単 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-05T22:18:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: 学ぶShrinky-Dinkを用いた胚様体形成法。遠心分離で細胞をマイクロウェルに簡単にロードし、従来のハンギングドロップ法よりも迅速で再現性の高い幹細胞培養を実現します。

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我々はこの作業の支援のためCIRMに感謝します。細胞株は、寛大にマウントサイナイ病院、トロント、オンタリオ州で博士アンドラーシュNagy氏から寄贈されました。

1。 Shrinky -ディンク金型を作る<ol><li>良い定義のプリンターを使用してshrinky -ディンクのシート上に所望のパターンを印刷します。 </li><li> 163で焼くshrinky -ディンクシート℃で約10分間、または完全に縮小し、定期的な形状を取得した時まで。 </li><li> shrinky -ディンクの金型冷却された後、イソプロパノール浴に浸し、それは完全な表面はほとんどカバーされるまで。 </li><li>慎重に、金型の上にいくつかのアセトンをスプレーし、容器を数回振る。アセトンの過剰を洗い流すとshrinky -カビがきれいになってまで、この手順を数回繰り返すよりイソプロパノール追加。 </li><li>残りの有機溶剤を洗い落とすために10分間蒸留水に浸けてカビ。 </li><li>エアクリーンshrinkyモールド。この意志コンパクトなインク163℃で約5分間、それを再加熱し、残りの溶剤を蒸発させる。 </li></ol> 2。 PDMSマイクロウェルの作成<ol><li> 10時01 PDMS /硬化剤の混合物を準備し、数分間激しく振とうする。 </li><li>小さなペトリ皿で​​行わshrinky -ディンクのモールド。それは金型表面上の約1 / 2 cmに達するまでPDMSの混合物を注ぐ。 </li><li> PDMSの混合物からすべての気泡を除去するため真空鐘の下に皿を置きます。 </li><li> 70℃のオーブンで行わ皿° C、一晩。 </li><li>金型から固体PDMSを遮断し、単に圧力を適用することにより、ガラススライドにバインドします。 </li><li>それは、PDMSとの間でincrustedインクの残基を有しているため、最初にマイクロチップを捨てる。 </li><li>インクフリーであると、より定義された形状を持つ別のチップを製造するには、この手順を繰り返します。 </li><li>クリーンマイクロチップの70％エタノール溶液を用いた。それを殺菌するために10分間UV光源の下に置きます。 </li></ol> 3。マイクロウェルにトラップ細胞<ol><li>細胞をカウントし、所望の濃度（希望するどのように多くの井戸の最初のセルに応じて）に培地でそれらを希釈する。例えば、ウェルあたり約10〜15セル（平均= 11、SD = 5.4、積載率= 93％）を得るために、我々は、8 × 10 4細胞/ mlの濃度を使用していました。 17 × 10 4細胞/ mlの濃度の場合、我々は確実によくあたり25〜35セル（平均= 27.17857 SDは= 7.7、積載率= 100％）得ることができる。 </li><li>慎重に固化したPDMSの塩基を含む50 ml遠心チューブにマイクロチップを置きます。 </li><li>細胞溶液の2JDP ml程度追加。 </li><li> 5 760 rpmで分、4℃のための遠心分離機</li><li>過剰の溶液からピペットで慎重にPBS 1Xソリューションをマイクロウェルを洗う。 </li><li>遠心管からチップを取り出しながら、注意しながら、小さなペトリ皿の中でのマイクロウェルを置きます。 </li><li> 1 X PBS溶液を用いて細胞の過剰を洗ってください。 </li><li>ウェルあたりの細胞の目的の数を確認するために倒立顕微鏡下でマイクロウェルチップを置きます。 </li><li>標準的な条件下でマイクロウェルを含む細胞をインキュベートする。 <img src="/files/ftp_upload/old/692_2008_7_21_1/692_Figure-01.png" alt="図- 01" width="350" height="183" /></li></ol> 4。細胞のインキュベーション<ol><li>ラボでの通常のEBのプロトコルに従ってください。 </li><li>徐々にチャンバーの側からメディアを変更してください。マイクロウェルに細胞を乱すことを避ける。 </li></ol>

<ol><li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, 862-869 (1995).</li>
<li>Doetschman, T. C., Eistetter, H., Katz, M., Schmidt, W., Kemler, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+in+vitro+development+of+blastocyst-derived+embryonic+stem+cell+lines%3A+Formation+of+visceral+yolk+sac%2C+blood+islands+and+myocardium%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Embryology+and+Experimental+Morphology%22%5BJournal%5D)">The in vitro development of blastocyst-derived embryonic stem cell lines: Formation of visceral yolk sac, blood islands and myocardium.</a> Journal of Embryology and Experimental Morphology. 87, 27-45 (1985).</li>
<li>Park, J., Cho, C. H., Parashurama, N., Li, Y., Berthiaume, F., Toner, M., Tilles, A. W., Yarmush, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication-based+modulation+of+embryonic+stem+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation.</a> Lab Chip. 7, 1018-1028 (2007).</li>
<li>Koike, M., Sakaki, S., Amano, Y., Kurosawa, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+embryoid+bodies+of+mouse+embryonic+stem+cells+formed+under+various+culture+conditions+and+estimation+of+differentiation+status+of+such+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Characterization of embryoid bodies of mouse embryonic stem cells formed under various culture conditions and estimation of differentiation status of such bodies.</a> J Biosci Bioeng. 104, 294-299 (2007).</li>
<li>Hwang, N. S., Varghese, S., Elisseeff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+differentiation+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Drug+Delivery+Reviews%22%5BJournal%5D)">Controlled differentiation of stem cells.</a> Advanced Drug Delivery Reviews. 60, 199-204 (2008).</li>
<li>Adelman, C. A., Chattopadhyay, S., Bieker, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+BMP%2FBMPR%2FSmad+pathway+directs+expression+of+the+erythroid-specific+EKLF+and+GATA1+transcription+factors+during+embryoid+body+differentiation+in+serum-free+media%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The BMP/BMPR/Smad pathway directs expression of the erythroid-specific EKLF and GATA1 transcription factors during embryoid body differentiation in serum-free media.</a> Development. 129, 539-549 (2002).</li>
<li>Tanaka, N., Takeuchi, T., Neri, O. V., Sills, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-assisted+blastocyst+dissection+and+subsequent+cultivation+of+embryonic+stem+cells+in+a+serum%2Fcell+free+culture+system%3A+applications+and+preliminary+results+in+a+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Laser-assisted blastocyst dissection and subsequent cultivation of embryonic stem cells in a serum/cell free culture system: applications and preliminary results in a murine model.</a> J Transl Med. 4, (2006).</li>
</ol>

Weは、微細加工井戸（Shrinky - DINKSから成形された）へのセルの定義済みの数値をロードし、胚様体の開発のためにそれらを維持するために、シンプル、迅速、かつスケーラブルな培養法を開発した。最後に、これらの細胞は、さらに分析と実験のために簡単にアクセス可能です。このメソッドは、どの研究室に適していると我々はフォトリソグラフィの必要性を未然に防ぐため、専用機器を必要としません。我々は、胚様体の数とサイズを変更するにはマイクロウェルの大きさだけでなく、細胞/ウェルの濃度を変化させることができます。

KO DMEM：40.8ミリリットル、81.6ミリリットルの15％KSR：7.5ミリリットル、15ミリリットル× 1ペン、連鎖球菌：0.5ミリリットル、1ミリリットル2mMのL -グルタミン：;：（100ミリリットル50ミリリットル調製した全メディアのための：）MESCメディア（マクロスキーラボプロトコル）のための0.5ミリリットル、1ミリリットルNEAA：0.5ミリリットル、1ミリリットルLIF：100ul、200ul BMP - 4（10ng/ml）：50UL、100ulの希薄化後BME：。50UL、100ul（PBSとシリンジフィルター5mlのために滅菌濾過BMEの35ulを追加する滅菌破棄2週間後。溶液中の最終濃度は0.1 mMのです）

滴をハンギングshrinky -ディンク：胚の体を形成し、文化に簡単

Shrinky-Dink Hanging Drops: A Simple Way to Form and Culture Embryoid Bodies

胚様体（EB）は、胚性幹細胞の集合体です。これらの集計を作成する最も一般的な方法は、ハンギングドロップ法、ウェルプレートに細胞を任意の数のピペッティングの面倒なアプローチです。互いの接近に強制的に幹細胞間の相互作用は、EBSの生成を促進。各ウェル内のメディアを手動で毎日交換する必要があるため、このアプローチは、手作業の多いです。 同一の条件下で培養するとさらに、細胞 - 細胞、細胞可溶性因子の相互作用は、pH、及び酸素の可用性を含む、環境パラメータは、EBの大きさの関数である可能性があるため、従来の吊り下げ降下から得られた細胞集団は、さらに劇的に異なることがあります。最近の研究では、実際に集計を形成する細胞の初期数は、幹細胞の分化に大きな影響を持つことができることが示されている。 Weは、微細加工のウェルに細胞の定義済みの数値をロードし、胚様体の開発のためのそれらを維持するために、シンプル、迅速、かつスケーラブルな培養法を開発した。最後に、これらの細胞は、さらに分析と実験のために簡単にアクセス可能です。このメソッドは、どの研究室に適していると、専用機器を必要としません。私たちは、赤色蛍光マウスの細胞株（129S6B6 - F1）を使用して胚様体を作成して、このメソッドを示しています。

我々は微細加工のウェルに細胞の事前定義された数値をロードし、胚様体の開発のためにそれらを維持するために簡単かつ迅速な方法を示しています。

滴をハンギングShrinky -ディンク：胚の体を形成し、文化に簡単

胚様体（EB）は、胚性幹細胞の凝集体である。これらの凝集体を作成する最も一般的な方法は、手間のかかるハンギングドロップ法である。

胚様体（Embroid bodies）は、胚性幹細胞の凝集塊です。これらの凝集塊を作成する最も一般的な方法は、吊り滴法（hanging drop method）です。これは、任意数の細胞をウェルプレートにピペッティングするという、手間のかかる手法です。培地および各ウェルプレートを毎日手動で交換する必要があるため、このプロセスは手作業の負担が大きくなります。さらに、最近の研究では、凝集体を形成する初期細胞数が幹細胞分化に影響を及ぼす可能性があることが示されています。この方法では、細胞数を事前に決定する手段はありません。このビデオでは、胚様体形成のために、微細加工されたウェルに異なる数の細胞を簡便かつ迅速に播種する方法を紹介します。こんにちは、カリフォルニア大学マーセド校工学部のMichelle K研究室のJonathan Paganです。そして、同じくK研究室のJesus Lunaです。本日は、遠心分離を用いて微細加工ウェル内に胚様体を形成させる手順について解説します。本手順は、マイクロデバイスの作製、幹細胞の播種、および幹細胞の培養というステップで構成されています。それでは、始めていきましょう。まず、高精細プリンターを用いて、シュリンキーディンク型を作製します。シュリンキーディンクシートに希望のパターンを印刷します。次に、シュリンキーディンクシートを160 °Cで約10分間、または完全に収縮して定まった形状になるまで加熱します。収縮したインク型を2分間放置し、触れて冷たくなっていることを確認します。表面全体がわずかに浸かるまで、イソプロパノール浴に浸します。収縮インクモールドをイソプロパノールに浸した後、モールドにアセトンを慎重にスプレーし、容器を数回振ります。次に、さらにイソプロパノールを加えて過剰なアセトンを洗い流します。収縮インクモールドがきれいになるまで、この手順を数回繰り返します。次に、型を蒸留水に10分間浸漬し、残留している有機溶媒を洗い流します。水への浸漬後、圧縮空気を用いてシュリンキーインク型をエアクリーニングし、160 °Cで約5分間再加熱します。これにより、インクが凝縮し、残った溶媒が蒸発します。それでは、PDMSマイクロウェルの作製に移ります。胚様体形成のために幹細胞を培養するためのPDMSマイクロウェルを作製します。PDMSと硬化剤を10:1の比率で混合し、数分間激しく攪拌します。次に、PDMS混合液を小型ペトリ皿に入れたシュリンキーディンク型の上に、型表面から約0.5 cmの高さまで注ぎます。注いだ後、型の表面に気泡が見られることが多いため、これらを除去する必要があります。皿を真空デシケーターに入れ、20分間静置してPDMS混合液からすべての気泡を除去します。すべての気泡が除去されたことを確認した後、ディッシュを7 °Cのオーブンに20分間置きます。インキュベーション後、カミソリで金型から固まったPDMSを切り出します。テープを用いて洗浄し、ウェルを上にした状態でガラススライドに接着させます。これは、端に圧力をかけるだけで簡単に行えます。次に、70% ethanol溶液で洗浄し、滅菌のためUV光源の下に10分間置きます。最初に行う際は、PDMSを廃棄してください。これにより、モールドに残っている余分なインク残渣を取り除くことができます。それ以降は、モールドをそのまま使用できます。成形手順をもう一度繰り返し、インクが付着しておらず、より形状が明確な2枚目のチップを作製します。親水性表面を作成してロードしやすくするため、作製開始前に必ず20秒間放電処理を行ってください。PMSマイクロウェルが完成すれば、Enid bodiesの研究に使用できます。それでは進めましょう。まず、細胞をカウントし、細胞培養培地を用いて目的の濃度に希釈します。この濃度は、ウェルあたりの初期細胞数に応じて決定します。1.5 × 10⁴ cells/mLで調製した場合、すべてのウェルに充填すると、1ウェルあたり14個の細胞が得られることがわかりました。凝固したPDMSベースを含む50 mL遠心チューブに、2 mLの細胞溶液を加えます。マイクロウェルチップを慎重に遠心チューブに入れ、760 RPMで5分間遠心分離します。次に、培地をピペットで吸い出し、マイクロウェルを小型ペトリ皿に移します。遠心分離チューブからチップを取り出す際、液をこぼさないように注意してください。次に、マイクロウェルチップを倒立顕微鏡下に置き、すべてのウェルに試料が充填されていることを確認します。チップをホルダーにセットし、細胞を含むマイクロウェルを標準条件下で24時間インキュベートします。細胞を維持するために、24時間後にチャンバーの側面からゆっくりと培地を交換します。マイクロウェル内の細胞を乱さないように注意してください。この操作は毎日行うことができます。この方法の利点は、従来の吊り滴法のようにウェルごとに培地を交換する必要がなく、一度のピペッティングですべての培地を交換できることです。ここまで、シュリンキーディンク（Shrinky Dink）の型を用いて細胞を培養し、胚様体を形成する方法について説明しました。この手法は、簡便で迅速であり、吊り滴法よりも手作業の負担が少ないため、非常に有用です。また、この方法ではフォトリソグラフィを必要としません。さらに、胚様体の形成に使用する初期細胞数を制御することも可能です。以上で説明を終わります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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