壊死性小腸炎の新生児マウスモデルと免疫細胞プロファイリングのためのLamina Propria分離

私たちの研究は、壊死性腸炎という医学的に脆弱な乳児に影響を与える疾患に焦点を当てています。私たちはNECにおける免疫応答に関与するメカニズムを解明し、早期診断と予防のための戦略を策定することを目指しています。新生児NECにおける腸内免疫細胞応答の研究は非常に困難です。本プロトコルは、フローサイトメトリーによる解析のために固有層免疫細胞を単離する方法を示すことで、このギャップを埋めています。

まず、壊死性全腸炎(NEC)を持つ乳児から培養した腸内細菌の培養を入手します。実験0日目の午後3時、培養液20マイクロリットルのアリコートを15ミリリットルの培養チューブにピペットで移し、その培養チューブには2ミリリットルのルリア・ベルタニブロスを含みます。細菌培養液は37度摂氏で1Gに設定された軌道シェーカーで16時間培養し、チューブ蓋を通気状態に保ちます。

同時に、2ミリリットルのルリア・ベルターニブロスだけを含む2回目の培養管を培養し、汚染の有無を検査します。翌朝7時に、夜間の細菌培養液125マイクロリットルを、25ミリリットルのルリア・ベルタニブロスを入れた通気蓋付きのT75細胞培養フラスコにピペット投与します。合計4個のT75フラスコを準備し、37度の軌道シェーカーで1Gに設定された状態で2時間、直立した状態でキュベートします。

実験1、2、3日目の午前9時に、乳児用粉ミルク16ミリットルと子犬用ミルク8ミリリットルを無菌50ミリリットルの遠心分離機管で混合し、ミルク混合物を準備します。ペレット入り細菌培養液を含む2本の50ミリリット遠心分離機から上清液を除去します。2つのペレットをそれぞれ2ミリリットルの調合したミルクにしっかりと再懸浮させます。

その後、2つの再懸濁混合物を残ったミルクに移し、合計24ミリリットルのNECフォーミュラを作ります。6つの給餌時間ポイントを50ミリリットルの遠心分離機チューブにラベル付けしてください。6本のラベル付きチューブそれぞれにNECの4ミリリットルをピペットで注ぎます。

次に、リポ多糖ストックを5ミリグラム/ミリリットルで6個の使い捨てアリコートを準備し、20度摂氏の低結合マイクロチューブで保存します。給餌直前にリポ多糖アリコートを1つ解凍し、15秒間ボルテックスします。計算されたリポ多糖の体積を4ミリリットルのNECフォーミュラチューブに加え、ピペッティングでよく混ぜます。

1ミリリットルの注射器に準備済みのNEC処方液を入れ、新生児用PICCラインに接続します。NECフォーミュラを経口ガベージで各子犬に投与するには、首の付け根のたるんだ皮膚で優しく固定し、子犬を直立させてください。PICCラインの挿入距離は、口の端から胃のミルクスポットの上部までの距離に等しいです。

PICCラインの最適な挿入ポイントは、永久マーカーでマーキングしてください。鉗子を使ってPICCラインを口咽頭に導き、胃の中へと導きます。抵抗がある場合は、PICCラインを取り外し、再配置し、再挿入を試みてください。

NECのミルク80マイクロリットルをゆっくりと胃に投与します。授乳中に子犬の誤嚥の兆候を観察してください。授乳後はPICCラインを外し、子犬の呼吸困難や嘔吐の有無を観察してください。

逆流が発生した場合は、低繊維の検査用ウェットで口と鼻を軽く塗ってください。すべての給餌時間のタイミングでこの給餌を繰り返してください。実験4日目に、安楽死した新生マウスの腸組織を採取します。

ハサミで腸を縦方向に切り開き、横方向に1〜1.5センチの区画に分割します。腸の区間を、氷の上で冷却した10ミリリットルの消化前溶液を含む15ミリリットルの遠心分離機チューブに移します。その後、37度の温度でチューブを20分間連続回転させて組織解離を開始します。

チューブを優しく回して緩んだ組織を取り除き、50ミリリットルの遠心分離機の上に置いた100マイクロメートルのセルストレーナーに中身を注ぎます。残った組織断片を新しい15ミリリットルの遠心分離機チューブに移し、10ミリリットルの消化液を37度に予熱しました。サンプルを37度Cで40分間連続回転させてキュベートします。

その後、内容物を自動組織解離チューブに移します。プログラムを4回、15秒ごとに時計回りと反時計回りに交互に回転させて実行します。解離が完了したら、解離管内の細胞懸濁液を優しくボルテックスし、300Gで4度の温度で5分間遠心分離します。

ペレットを乱さずに上清液を慎重に吸引してください。細胞を1ミリリットルの氷のように冷たい蛍光活性化細胞選別バッファーに再懸浮させます。100マイクロメートルのセルストレーナーを50ミリリットルの遠心分離機管の上に置きます。

再懸濁した細胞をストレーナーに通し、2ミリリットルの冷たい蛍光活性細胞選別バッファーで洗浄します。分離された細胞数を数え、トリパンブルーまたは生存性染料を使って生存可能性を評価します。フローサイトメトリー用の望む体積を300G、4度Cで5分間遠心分離します。

NEC治療群ではダム給水対照群と比較して生存命率が有意に低下したことが観察されました。NECマウスの粗腸検査では、健康な対照群と比較して膨張、空気の蓄積、腸気気過症の目に見える兆候など、NECの特徴が示されました。ヘマトキシリンおよび嗜酸染色により、NECマウスでは絨毛の破壊が斑点的で、対照群では絨毛が損傷したのに対し、腸構造が乱れていることが明らかになりました。

NL1B、CXCL2、LCN2メッセンジャーRNAの発現は、NEC群で対照群よりも有意に高かった。腸内葉固有性葉の総CD45+免疫細胞は、NEC群と対照群で有意差はありませんでした。NEC腸のマクロファージ値は対照群と比較して有意に上昇していました。

NECマウスでは、他の免疫サブタイプと比べて、特に単球およびマクロファージを含む骨髄細胞の割合が増加しました。単一細胞マルチオミクス手法はNECにおける免疫細胞の特徴を明らかにし、メカニズムや潜在的なバイオマーカーに関する新たな洞察をもたらしています。NECのモデル化は、この疾患が多因子性であるため困難です。

新生マウスにおける人間の腸内環境、免疫応答、微生物の影響を再現するには、慎重な最適化が必要です。本モデルはヒト由来のマイクロバイオーム、低酸素症、粉ミルク摂食を統合しており、新生マウスの詳細な免疫細胞プロファイリングに生理学的に適合しています。