培養細胞における官能化ナノボディを用いたエンドサイトーシス輸送の生細胞イメージング

膜貫通タンパク質のエンドサイトーシスおよび逆行性輸送、そして輸送をもたらすメカニズムを研究しています。細胞表面からのタンパク質輸送を調べる際には通常、従来の抗体が用いられますが、これらは架橋やリソソーム標的化を促進する可能性があります。まず、VHH-mCherryで形質転換した大腸菌のペレットを入手します。

細菌細胞ペレットに20ミリモラーイミダゾールを含む氷冷結合バッファー30ミリリットルを加えます。ピペットでペレットを上下にピペットしてしっかり再懸浮させます。再懸濁した混合物をラベル付きの50ミリリットル遠心分離機管に移します。

再懸濁細胞にはリゾザム200マイクログラム/ミリリット、DNase I20マイクログラム/ミリリットル、マグネシウム塩化物1ミリモラ、フェニルメチルスルフッ化物1ミリモラを補足します。室温で10分間培養した後、前後回転の回転子に置き、4度で1時間培養を続けます。次に、ソニケーターの6ミリメートルの固体プローブの先端を直接セル懸濁液に挿入します。

細菌細胞を機械的に破壊し、振幅40%の1分間の超音波パルスを3回、デューティサイクルは1秒オン、1秒オフで行う。各パルスの間に1分間の冷却間隔を設けています。遠心分離後、クリアした溶解液を氷上に保管し、重力流運転用の事前充填済みの使い捨てタグ精製カラムを用いて固定金属親和性クロマトグラフィーの準備を行います。

ニッケル-ニトリロトアケ酸カラムを金属スタンドまたは適切なカラムホルダーに固定します。その後、カラムの貯蔵バッファを完全に排水します。PBS中に20ミリモラーイミダゾールを含む結合バッファー10ミリリットルを加えてカラムを平衡させます。

バッファーが重力で通過するのを許してください。平衡カラムに約30ミリリットルのクリア済み細菌溶解液を徐々に塗布します。重力で流れを流し、流れるものは捨てます。

次に、PBSに20ミリモラーイミダゾールを含む結合バッファーを2回連続で10ミリリットル量で塗布してカラムを洗浄します。結合したナノボディを、PBS中の500ミリモラーイミダゾールを含む2ミリリットルの洗脱バッファーを2ミリリットルのマイクロ遠心分離管に浸出します。50ミリリットルのチューブアダプターにシードされた脱塩カラムを、PBS5ミリリットルで5回洗い流して平衡させます。

バッファーが完全に充填された樹脂に入り、流れを捨てます。最終すすぎ後、1000 x gでカラムを2分間遠心分離します。次に、フローを廃棄した後、アダプター付きのカラムを新しい50ミリリットルの集水管に移します。

脱塩カラムに2ミリリットルの脱塩剤を施します。その後、再び1000 x gで遠心分離機で2分間ルーオートを採取し、VHH-mチェリーの発現と純度を確認します。自動生細胞イメージングシステムのソフトウェアを起動してください。

ibidi顕微鏡チャンバーを顕微鏡ステージに移す。EGFPとmCherry用に励起フィルターと放出フィルターを用いて2つのイメージングチャンネルを設置します。光漂白を防ぐために、露光時間は短く、照明強度も低くしましょう。

すべての実験で設定は一定に保ちましょう。リポーターによって設定は異なる場合があります。各条件に対して、3〜4つのフォーカスが合う10個の異なる視野角の座標をポイントリストに格納します。

次に、ポイントリスト内の各位置のスナップショットを1枚ずつ撮影し、参照画像として使用し、VHH-mCherryを追加します。エンドサイトーシスを開始するには、各ウェルに予熱されたVHH-mCherry溶液350マイクロリットルを優しく加え、単一層への乱れを最小限に抑えます。次に画像取得を進めます。

32秒間隔で100フレームのタイムラプス取得を行い、37度の温度と5%の二酸化炭素を維持します。VHH-mCherryのエンドサイトーシス取り込み解析を行うには、タイムラプス画像セットを画像解析ソフトウェアに読み込みます。セグメンテーションおよびトラッキングツールを適用し、異なる関心領域にわたる内部化された蛍光を時間とともに定量化します。

すべての官能化ナノボディバリアントは高収量かつ高純度に精製され、VHH-mCherryのみが軽度のプロテオリシス分解を示しました。VHH-mCherryの分解生成物は、エピトープ特異的免疫ブロット検出を用いて個々のVHH-mCherryドメインであることが確認されました。BirAが存在しない場合、VHH-mCherryは1回あたり約20ミリグラムで回収されました。

また、ナノボディBSA混合物のストレプタビジンアガロースプルダウンによってビオチニル化が確認されました。HeLa細胞で発現したEGFPタグ付き融合タンパク質は、EGFP-CDMPRおよびEGFP-CIMPRの核周局在を含む内因性の対応物と一致する細胞内局在パターンを示しました。EGFP-TGN46の核周局在およびTfR-EGFPの末梢局在。

VHH-mCherryはEGFP-CDMPRのエンドサイトーシス輸送のライブ細胞可視化を可能にし、60分経過で共局在の進行が示されました。VHH-mCherryのEGFP-CDMPR発現細胞への取り込みは約43分後に停滞し、半減期は9分でした。TfR-EGFP発現細胞では、VHH-mCherryは細胞間で急速に蓄積し、半減期は4分、飽和は20分で完了しました。

細胞表面からの膜貫通タンパク質の輸送を解析するための多用途なナノボディツールキットを確立しました。蛍光ナノボディを使って表面カーゴタンパク質を標識し、その後、生細胞顕微鏡によるエンドサイトーシス輸送を研究しています。ナノボディベースの生細胞イメージング手法により、地表からゴルジ体を介したネットワークの貨物輸送を駆動する経路を明らかにしたいと考えています。