K562細胞のエピジェネティック工学:dCas9-DNMT3Aおよび-HDAC1融合タンパク質を用いた安定な標的DNAメチル化のためのデュアルベクターエピソーム戦略

私たちの研究は、K562細胞における持続的なエピジェネティック編集を探求し、安定した非統合型DNAメチル化システムの開発を目指しています。最近の進展としては、エピジェネティック酵素を組み合わせて相乗効果的で安定的かつ局所特異的なエピジェネティック修飾を行う二重効果体CRISPR-dCas9システムがあります。まず、T75培養フラスコ内のK562細胞を37度C、5%二酸化炭素、加湿条件下で維持します。

トランスフェクションに使用するエピソーマルDNAを260ナノメートルの分光光度計で定量します。1回のトランスフェクションで合計8マイクログラムのプラスミドDNAを使用し、各プラスミドを4マイクログラムずつ調製し、必要な量を90マイクロリットルの超純水と混合します。次に、薄めたDNA溶液に3モル酢酸ナトリウム溶液10マイクロリットルと100%エタノール2.5ボリュームを加えます。

DNA溶液を十分に混ぜ、20度摂氏で一晩培養してDNA沈殿を促します。翌日、DNA沈殿管を11,000Gで4度の温度で15分間遠心分離します。バイオセーフティキャビネット内の無菌条件下で、チューブから上清液を慎重に捨ててください。

チューブに70%エタノールを500マイクロリットル加えてペレットを洗浄し、再び11,000Gで4度の温度で5分間遠心分離します。次に、チューブからエタノール上清液を完全に取り出し、DNAペレットを自然乾燥させて目に見えるエタノールが残らなくなるまで放置します。その後、乾燥したDNAペレットを50マイクロリットルのDMEMにしっかりと再懸濁します。

再懸濁したDNAを約2.5マイクロリットルの400ナノグラムを新しいチューブに保管し、プラスミドDMEM溶液は4度の温度で保存し、使用後は再利用します。残りのDNAサンプルを1%アガロースゲルで解析し、DNAの精製と完全性を確認します。培養が50〜60%のコンフルエンシーに達した際にT75フラスコからK562細胞を採取し、最適なトランスフェクション効率を確保します。

採取した細胞数をヘモサイトメーターで数え、2×10の5細胞の乗数をFBSや抗生物質なしの35ミリメートル培養皿に900マイクロリットルのDMEMを収録した培養皿に移します。培養皿を37度のインキュベーターに5%の二酸化炭素を入れて、細胞をトランスフェクションの準備状態に保ちます。リポフェクタミン系トランスフェクションキットを使って、メーカーの指示に従いプラスミドを送達し、必要に応じて体積を調整してください。

事前に準備されたプラスミドDMEM溶液に3マイクロリットルのP3000試薬を加えます。優しく混ぜ、室温で5分間培養します。次に、リポフェクタミン3000試薬5マイクロリットルと、最終体積100マイクロリットルに達するための十分なDMEMを加えます。

このトランスフェクションミックスを室温で15分間培養します。細胞を含む35ミリメートルの培養皿にトランスフェクション混合物の100マイクロリットルを全て加えます。皿を優しく振って混合物を均等に分散させ、その後インキュベーターに戻します。

トランスフェクション後24時間後、各皿に10%FBSと1倍のペニシリンストレプトマイシンを補足した全培地DMEM3ミリリットルを加え、トランスフェクト細胞の増殖を促進します。形質染色後72時間後、G418抗生物質を追加して最終濃度1ミリグラム/ミリリットルに到達し、選択を開始します。選択プロセスが確立され、細胞数が1×10の6の乗を超えたら、300Gで25度の遠心分離で6分間採取します。

ペレットを一度だけ無菌PBSで洗浄し、pHは約7.4で、同じ条件で再び遠心分離機をかけます。最終細胞ペレットを1回PBSで再懸浮させた後、ヘモサイトメーターで細胞濃度を測定します。懸濁液を1ミリリットルあたり6細胞の1乗に希釈し、細胞を完全に再懸浮させ、細胞をフローサイトメトリーチューブに移します。

次に、蛍光活性化細胞選別機を96ウェルの組織培養処理プレートを収集装置として単一細胞モードに設定します。使用する楽器に応じてソフトウェアの設定を調整してください。一次集団を前方散乱と側散乱に基づいて細胞選択し、予想されるサイズと粒度を分離します。

破片や高度に粒状化または死んだセルを除外し、前方散乱面積と高さ、または側散乱面積と高さのプロットを使ってゲートシングレットを行います。その後、96ウェルプレートの各ウェルに1ミリグラム/ミリリットルのG418を含む100マイクロリットルのフル培地をあらかじめ充填し、37度のインキュベーターでプレートを温めます。セルソートは単一セルモードで行い、ソート速度を毎秒300件未満に抑えて精度を向上させます。

選別後、各ウェルを顕微鏡で調べて1つのセルが存在するか確認し、プレートを5%二酸化炭素を含んだ37度のインキュベーターに入れます。単一セルクローンを96ウェルプレート内で個別に増殖させます。クローンの成長が明らかになったら、還元されたG418を含む培地をウェルに加え、最終濃度400マイクログラム/ミリリットルに保ち、選択圧を維持します。

ウェル増殖クローンを順次12ウェルプレートに移し、次にT25フラスコ、最後にT75フラスコへと必要に応じて移し、各クローンが約1×10の6の乗に到達するまで移動します。次に、一定間隔で二重細胞のペレットを集めます。ゲノムDNA抽出のために、1粒をマイナス20度の温度で保存してください。

2つ目のペレットを500マイクロリットルのTRIzol試薬で均質化し、RNA抽出と相補DNA合成のためにマイナス20度の環境で保存します。フェノール-クロロホルム抽出とエタノール沈殿を用いて、選択されたクローンからゲノムDNAを抽出します。抽出したDNAをヌクレアーゼフリー水またはTEバッファーに完全に再懸濁させます。

下流のステップに進む前に、分光光度計でDNA濃度と純度を測定してください。最後に、TRIzol試薬を用いて貯蔵細胞ペレットから全RNAを抽出し、その後イソプロパノール沈殿を行います。単一細胞は蛍光活性化細胞選別を用いて96ウェルプレートに分類され、両方の構成要素を持つ細胞を分離しました。

拡張された10個のクローンに対するPCR解析では、230塩基対と205塩基対のバンドで示される一部の構成要素のみが保持していることが確認されました。パイロシーケンシングにより、陽性クローン2は未トランスフェクト対照群と比べてgRNA1標的領域近くの複数のCPG部位でメチル化が増加していることが明らかになりました。統合されていない長期配送システムの不足に対処し、宿主ゲノムを改変せずに正確で安定したエピジェネティック編集を可能にします。

私たちの発見は、標的メチル化を通じた遺伝子調節を研究する信頼性の高いツールを確立し、正確なエピジェネティック治療の開発を支持しています。今後の研究では、エピソーマル送達の改善、標的効果の最小化、Cas9効率の強化、そして一次モデルやin vivoモデルへの適応が検討されます。