Name: GMPスケーラブルデバイスにおけるCAR-Tおよびサイトカイン誘導キラー細胞の効率的かつ迅速な生成 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-05T12:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: 学ぶG-Rexデバイスを用いたCAR-T細胞とCIK細胞のスケーラブルな大量培養法。最小限の操作で高い増殖率と細胞生存率を確保し、臨床応用への移行を効率化する標準化プロトコルを解説します。

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<li>Erskine, C. L., Henle, A. M., Knutson, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+optimal+cytotoxic+activity+of+human+HER2%2Fneu-specific+CD8+T+cells+by+comparing+the+Cr-51+release+assay+to+the+xCELLigence+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Determining optimal cytotoxic activity of human HER2/neu-specific CD8 T cells by comparing the Cr-51 release assay to the xCELLigence system.</a> J Vis Exp. (66), e3683(2012).</li>
<li>Eberhardt, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+serum-free+media+on+the+expansion+and+functionality+of+CD19.CAR+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Impact of serum-free media on the expansion and functionality of CD19.CAR T-cells.</a> Int J Mol Med. 52, 58(2023).</li>
<li>Cadiñanos-Garai, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-dimensional+temporal+mapping+of+CAR+T+cells+reveals+phenotypic+and+functional+remodeling+during+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">High-dimensional temporal mapping of CAR T cells reveals phenotypic and functional remodeling during manufacturing.</a> Mol Ther. 33, 2291-2309 (2025).</li>
<li>Wang, X., Byrne, M. E., Liu, C., Ma, M. T., Liu, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+process+development+of+NK+and+CAR-NK+expansion+in+a+closed+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Scalable process development of NK and CAR-NK expansion in a closed bioreactor.</a> Front Immunol. 15, 1412378(2024).</li>
<li>Noldner, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+lung+cancer+tumor-infiltrating+lymphocyte+%28TIL%29+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Improving lung cancer tumor-infiltrating lymphocyte (TIL) manufacturing.</a> Cytotherapy. 27, 1240-1250 (2025).</li>
<li>Bandeira, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Downstream+processing+of+lentiviral+vectors%3A+Releasing+bottlenecks%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther+Methods%22%5BJournal%5D)">Downstream processing of lentiviral vectors: Releasing bottlenecks.</a> Hum Gene Ther Methods. 23, 255-263 (2012).</li>
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養子細胞療法(ACT)は、がん治療における先進的な治療の重要な柱となっています。このアプローチは、抗腫瘍効果を得るために体外拡張細胞産物を投与することに基づいています。これまでにACTでは多くの細胞タイプが用いられており、抗原非特異的アプローチ(例:ナチュラルキラー(NK)2、サイトカイン誘導キラー(CIK)3,4、ナチュラルキラーT(NKT)5、γδT細胞6から、腫瘍浸潤リンパ球(TILs)7やキメラ抗原受容体(CAR)1などの遺伝子組みづけ治療法まで、高度に特異的かつ個別化されたものまで多岐にわたります。8およびT細胞受容体(TCR)細胞9,10。
CAR-T細胞は、遺伝子組み換えT細胞で、特定の分子標的を認識する合成免疫受容体を発現するために生じる生 体 外ウイルスの伝達によって生成されます。CAR構造は、抗原特異的単鎖可変フラグメント(scFv)抗体と、TCRζ鎖や共刺激分子を含む細胞内シグナル伝達ドメインを組み合わせたものです。抗原結合後、細胞内ドメインは活性化シグナルを伝達し、T細胞増殖と抗腫瘍活性を促進する11。
CIK細胞は、活化したTリンパ球の異質な集団であり、末梢血単核細胞(PBMC)や臍帯血(UCB)からの生体外拡張時にCD56の発現を獲得します12。この増殖には、インターフェロンγ(IFN-γ)、抗CD3モノクローナル抗体、インターロイキン2(IL-2)による刺激と、IL-2内で14日間の培養が含まれます。CIK細胞は機能的にNK細胞とT細胞の両方に似ており、主要な組織適合複合体(MHC)に依存しないおよび依存的なメカニズム(13,14,15,16)を通じて抗腫瘍活性を発揮します。これらの特性により、CIK細胞は移植片対宿主疾患(GvHD)リスクを最小限に抑え、異体および自家治療の両方で使用可能となっています17。
臨床現場では、CAR-TおよびCIK細胞療法の両方に大量の細胞投与が必要です。CAR-T細胞は患者18人あたり5,000万〜2億回分の注入を受けます。同様に、CIK細胞は通常、1回の点滴で最大100億細胞が投与され、治療プロトコルに応じて複数回の点滴を受けることも多いです。フラスコやプレートを用いた従来の細胞培養法は非効率的で時間がかかり、頻繁な転移が必要で大規模な増殖が不可能で汚染リスクが高まります。バッグ培養やバイオリアクターを用いた自動化または半自動化システムは大規模な拡張を可能にしますが、せん断応力や密度調整、頻繁な媒質灌流の必要性、そして一度に1バッチずつの取り扱いが必要であり、学術・産業の両面で高コストとなるという制約があります。この困難な状況下で、代替案としてはガス透過性急速膨張装置(G-Rex)が挙げられます。これは井戸底部にシリコン膜を配置した静的培養法で、効率的な酸素交換と容器の高さ増加を実現し、大量の中容量を可能にしています。したがって、このシステムは培地置換や密度調整なしに細胞の増殖をサポートします22,23。G-Rex-Mシステムは最大5000 mLまでのスケーラビリティを示しており、自動収穫システムとも互換性があり、汚染のない閉鎖培養プラットフォームを提供し、学術現場から臨床現場へと容易に応用可能な先進的な治療薬品(ATMP)24。
この手順では、G-Rexデバイスの利点と特性を活かし、CAR-T細胞とCIK細胞の増殖プロトコルを最適化しました。両細胞タイプが効率的に増殖・拡大でき、異なる培養システム間で一貫した表現型と機能プロファイルを維持できることを実証しました。CIKセルとCAR-Tセルの両方の拡張プロトコルの概観は 図1に示されています。
<img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig1v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
図1:G-24またはG-6M培養装置を用いたCAR-TおよびCIK細胞拡張プロトコルの概要。 CAR-TおよびCIK細胞は、単離PBMCから0日目から増殖されます。CAR-T細胞の増殖のために、PBMCは1日目に抗CD3および抗CD28抗体で刺激され、2日目に遺伝子組み換えを行い、その後3〜4日ごとにhIL-7およびhIL-15補足で培養され、機能的アッセイのために9日目に最終収穫が行われます。G-6M形式では、サイトカイン補給は2日目に限定され、培養期間中は追加のサイトカイン摂取は不要です。CIK細胞の増殖のために、PBMCは1日目にrhIFN-γで刺激され、2日目に抗CD3抗体とrhIL-2で刺激され、3〜4日ごとに提供されます。G-24では、サイトカインサプリメントと同時に中度の変更が必要です。CIK細胞は14日目に採取され、下流の機能分析を行います。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>

<table><tbody><tr><td>ブリリアントステインバッファー</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>566349</td><td></td></tr><tr><td>CD28抗体、抗ヒト抗体</td><td>ミルテニ・バイオテック</td><td>130-093-375</td><td>クローン 15E8</td></tr><tr><td>CD3抗体、抗ヒト抗体</td><td>ミルテニ・バイオテック</td><td>130-093-387</td><td>クローンOKT3</td></tr><tr><td>CD3 BV510</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>740147</td><td>クローンUCHT1</td></tr><tr><td>CD314 装甲兵員輸送車(NKG2D)</td><td>バイオレジェンド</td><td>320808</td><td>クローン1D11</td></tr><tr><td>CD4 BV650</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>563875</td><td>クローンSK3</td></tr><tr><td>CD45RA PerCP-Cy5.5</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>563429</td><td>クローンHI100</td></tr><tr><td>CD56 PE</td><td>バイオレジェンド</td><td>318306</td><td>クローンHCD56</td></tr><tr><td>CD62L FITC</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>555543</td><td>クローンFREG-56</td></tr><tr><td>CD8 BV450</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>562428</td><td>クローンRPA-T8</td></tr><tr><td>CellTrace バイオレット細胞増殖キット</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>C34557</td><td></td></tr><tr><td>ジメチルスルホキシド(DMSO)</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>ダルベッコ&プライム;sリン酸塩緩衝生理食塩水(D-PBS)</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>D5652</td><td></td></tr><tr><td>Eプレート16</td><td>アジレント</td><td>5469813001</td><td></td></tr><tr><td>胎児用牛血清(FBS)、価値</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>修復可能な実効性のステイン780(FVS780)</td><td>BDバイオサイエンス</td><td>565388</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 24ウェルプレート&nbsp;</td><td>ウィルソン・ウルフ</td><td>80192M</td><td></td></tr><tr><td>G-Rex 6Mウェルプレート&nbsp;</td><td>ウィルソン・ウルフ</td><td>80660M</td><td></td></tr><tr><td>HEPESバッファソリューション</td><td>ロンザ</td><td>ECM0180D</td><td></td></tr><tr><td>彼の抗体</td><td>ミルテニ・バイオテック</td><td>130-120-718</td><td></td></tr><tr><td>ヒトアルブミン 20%</td><td>CSLベーリング</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヒトIL-15組換えタンパク質</td><td>ペプロテック</td><td>200-15</td><td></td></tr><tr><td>ヒトIL-7組換えタンパク質</td><td>ペプロテック</td><td>200-07</td><td></td></tr><tr><td>LSRフォーテッサ X-20</td><td>BDバイオサイエンス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リンポレップ</td><td>STEMCELL テクノロジーズ</td><td>18060</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td>乳がん細胞株&nbsp;</td></tr><tr><td>ペニシリンとストレプトマイシン</td><td>ロンザ</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>生理用溶液(0.9%塩化ナトリウム)</td><td>モニコ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>プロタミン硫酸塩</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>P3369</td><td></td></tr><tr><td>ラジ</td><td>ATCC</td><td>CCL-86</td><td>バーキットリンパ腫細胞株&nbsp;</td></tr><tr><td>組換えヒトIFN-γ</td><td>R&Dシステムズ</td><td>285-IF-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>組換えIL-2(プロロイキン)</td><td>ノバルティス</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rhCD19-His</td><td>インビトロジェン</td><td>A42607</td><td></td></tr><tr><td>ロズウェル・パーク記念研究所 1640年(RPMI-1640)</td><td>ユーロクローン</td><td>ECB9006L</td><td></td></tr><tr><td>安定L-グルタミン</td><td>ロンザ</td><td>ECB3004D</td><td></td></tr><tr><td>トリパンブルー溶液</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>xCELLigenceリアルタイムセル解析</td><td>アジレント</td><td></td><td></td></tr><tr><td>X-VIVO 15 血清フリー造血培地</td><td>ロンザ</td><td>02-053Q</td><td></td></tr></tbody></table>

gmpスケーラブルデバイスにおけるcar-tおよびサイトカイン誘導キラー細胞の効率的かつ迅速な生成

Efficient and Rapid Generation of CAR-T and Cytokine-Induced Killer Cells in GMP-scalable Devices

ここで述べるプロトコルは、分離されたPBMCからエフェクターセル(特にCAR-TおよびCIKセル)からのエクスビブ増殖および工学的効率的かつ堅牢なワークフローを提供します。この方法は最小限の細胞操作で済み、G-Rex装置のガス交換能力を活かし、従来の静的培養システムに比べて優れた栄養供給と酸素供給を提供します(23,24)。このプロトコルの大きな利点は、前臨床研究に適した小規模な24ウェルデバイス(G-24)から、トランスレーショナルや臨床製造のニーズに適合し、比例スケーリング以外のプロトコルの変更を必要としない、より大きな6Mデバイス(G-6M)まで、固有のスケーラビリティがあることです。
このプロトコルを用いて、CAR-TおよびCIK細胞は健康なドナーPBMCからG-24およびG-6M形式で並行して増殖に成功しました(セクション2-4に記載)。培養期間終了時には、両細胞タイプとも高いフォールド拡大と生存率を示し、両デバイスフォーマット間で同等の増殖率が見られました(図2、 補足表1、補足表2)。これにより、プロトコルの異なる培養スケールでの再現性が示されました。
培養装置のスケーラビリティを検証するために、エフェクター細胞は表現型および機能的にさらに特性評価されました。CD19 CAR-T細胞については、CAR発現を定量し、CD4+およびCD8+サブセットを評価し、CD19 CAR+ CD8+ T細胞の優位性を確認しました(図3A-B、補足表1)。CIK細胞では、T(CD3+CD56-)、NK(CD3-CD56+)、CIK(CD3+CD56+)集団の頻度(図3D)および活性化受容体NKG2Dの発現を評価しました(図3E、補足表2)。さらに、CAR-TおよびCIK細胞のG-24およびG-6M培養フォーマット間で、全体的に比較可能な表現型および特定の集団マーカーの発現が観察されました。CD19 CAR-TおよびCIK細胞産物の分化状態はCD62LおよびCD45RA染色で解析され(図3C-F、補足表1、補足表2)、G-24およびG-6M形式で培養された細胞間で類似した記憶表現型およびエフェクター表現型が明らかになりました。これらの発見は、拡大したエフェクター細胞群の表現型の完全性や分化状態を損なわないことを示しています。
最後に、機能的有効性を評価するために、標的特異的細胞毒性アッセイを用いました。いずれのデバイスでも増殖したCD19 CAR-TおよびCIK細胞は強力な細胞溶解活性を示し、スケールを超えて機能的性質が維持されていることを裏付けました(図4)。総じて、これらの結果は拡張された製品の前臨床モデルへの応用や臨床試験への適合性を支持しています。
<img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
図2:CD19 CAR-TおよびCIK細胞の増殖と生存可能性。 G-24およびG-6MプレートのPBMCから増殖したCAR-T細胞(n=5)およびCIK(n=6)を、それぞれ増殖9日目と14日目に採取し、細胞数および(A-C)フォールド増加率および生存可能細胞の(B-D)パーセンテージの評価を行いました。ヒストグラムは標準偏差(SD)±平均式を表し、点は単一ドナーを示します(個別値は 補足表1 および 補足表2 を参照)。データは、両側多重対t検定(A-C)または複数両側ウィルコクソンマッチペアランク検定(B-D)で解析され、複数比較時にはHolm-Sidak補正(*p &lt; 0.05)を用いました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig3v2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
図3:G-24およびG-6Mデバイスで増殖したCD19 CAR-TおよびCIK細胞の表現型評価。CD19 CAR-T細胞(n=5)におけるCAR分子の発現をフローサイトメトリーで解析し、(A)G-24およびG-6M増殖プロトコルにおけるトランスダクション効率、ならびにCD3+CAR+サブセットにおける(B)CD4+/CD8+および(C)ナイーブ/メモリーサブポピュレーションの発現を評価しました。バルクCIK細胞(n=6)の表現型をフローサイトメトリーで解析し、(D)CIK(CD3+CD56+)、NK(CD3-CD56+)、T(CD3+CD56-)の割合、およびCD3+CD56+サブセット(G-24 n=5, G-6M n=6)における(E) NKG2Dおよび(F) ナイーブ/メモリサブポピュレーションの発現を調べました。ナイーブ(CD45RA+CD62L+)、中央メモリ(CM、CD45RA〜CD62L+)、エフェクターメモリー(EM、CD45RA〜CD62L-)、およびエフェクターメモリCD45RA陽性(EMRA、CD45RA+CD62L-)です。ヒストグラムは標準標準差±平均表現を表し、点は単一ドナーを示します(個別値は補足表1および補足表2参照)。データは、両側多重対t検定(B-C-D-F)または両側ウィルコクソンマッチング検定(A-E)で解析され、複数比較時にはホルム・シダック補正(*p &lt; 0.05)が適用されました。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69369/69369fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
図4:CD19 CAR-TおよびCIK細胞細胞傷害の評価。 (A) 6時間フローサイトメトリーを用いた殺菌アッセイにより、バーキットリンパ腫ラジ細胞株に対してCD19 CAR-T細胞(オレンジ、n = 5)または未換面(UTD、n=5)細胞の特異的溶解(懸濁細胞株モデルとして)を実施しました。結果はSD±の平均特異的溶解として示されています。(B) 乳がんMCF-7細胞株に対して、G-24(淡青色、n = 7)またはG-6M(濃青色、n=6)で培養したCIK細胞の細胞傷害性(接着細胞株モデルとして)はリアルタイム細胞解析装置を用いて24時間にわたり15分ごとにモニタリングされました。結果はSEM±の平均特異的溶解として示されています。データはMann-Whitney検定、Holm-Sidak補正による多重比較(*p &lt; 0.05)で解析されました。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/69369fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
補足図1:フローサイトメトリー解析に用いられるゲーティング戦略。 (A) CAR-T細胞および(B) CIK細胞の表現型特性解析、(C) 蛍光細胞染料を用いた細胞毒性アッセイのゲーティング戦略を示す代表的なプロット。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_Figure%201_RE.pdf" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>
補足表1:個々のドナーからのCD19 CAR-T細胞培養の成長、生存可能性、表現型。 各ドナーごとに、培養9日目に採取したCD19-CAR T細胞の総細胞数、フォールド増加、生存率、表現型の特徴を示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_1_RE.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>
補足表2:個々のドナーからのCIK細胞培養の成長、生存可能性、表現型。 G-24およびG-6Mデバイスで培養14日目に採取されたCIK細胞の総細胞数、折りたたみ増加、生存率、表現型の特徴付けを各ドナーごとに示しています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69369/Suppl_table_2_RE.xlsx" target="_blank">このファイルをダウンロードするにはこちらをクリックしてください。</a>

GMPスケーラブルデバイスにおけるCAR-Tおよびサイトカイン誘導キラー細胞の効率的かつ迅速な生成

Adoptive cell therapies (ACT) have progressed rapidly in recent years, playing a pivotal role in cancer immunotherapy and significantly influencing ...

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化学療法と放射線標準治療のリンパ球除去および免疫調節効果は、T細胞免疫療法の抗腫瘍効果を高めるために活用することができます。EGFRvIII特異的キメラ抗原受容体(CAR)T細胞を作製し、膠芽腫の標準治療の文脈でそれらを投与する方法を概説します。...

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ここでは、CRISPR/Cas9システムを介してCAR-T細胞を遺伝的に編集するプロトコルを提示する。...

CRISPR/Cas9を使用してCAR-TセルのGM-CSFをノックアウト

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本稿では、臨床用のキメラ抗原受容体T細胞の製造プロセス、特にT細胞のウイルス形質導入および培養を行うことができる自動細胞プロセッサーの使用について詳述する。私たちは、初期段階の臨床試験のプロセス開発と実施中に考慮すべき推奨事項を提供し、落とし穴について説明します。...

自動セルプロセッサーでのキメラ抗原受容体T細胞製造

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マウスキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞の効率的な作製

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