哺乳類細胞における細胞膜および細胞内ニコチン性アセチルコリン受容体の局在化

ニコチン性アセチルコリン受容体が哺乳類の細胞膜に輸送される現象を理解することは、シャペロン介在の調節の調査や標的選択的治療法の評価に不可欠です。pH感度プローブと生細胞共焦点顕微鏡の組み合わせの主な利点は、サブユニット位置の高い空間分解能です。まず、試薬を37度まで予温します。

nAChRサブユニットのDNaseを完全に解凍し、トランスフェクション試薬を室温に移します。すべての試薬をバイオセーフティキャビネットに入れる前に70%エタノールで洗浄してください。アルファ7 nAChRを発現させるために、マイクロ遠心分離管内でアルファ7およびナチョプラスミドDNaseを希釈して還元血清培地に溶け込ませます。

DNA添加後にピペッティングで優しく混ぜます。あるいは、α-4β-2受容体を発現させるために、各サブユニットDNAの4マイクログラムを希釈し、合計250マイクロリットルの還元血清培地に溶け込み、優しく混ぜます。特定の受容体アイソフォームの発現を最適化するためにサブユニット比率を調整してください。

プラスミドが加わったα-4β-2受容体には、各プラスミドDNAを等量添加します。次に、新しいマイクロ遠心分離管で8マイクロリットルのトランスフェクション試薬を250マイクロリットルの還元血清培地に滴下して薄めます。室温で5分間の培養後、希釈したDNaseと希釈したトランスフェクション試薬を滴下してチューブに混ぜます。

ピペットで優しく混ぜ、室温で20分間培養します。複合体が形成される間は、培養皿の培地を1ミリリットルの血清フリーEMEMに置き換えてください。各皿に500マイクロリットルのDNAトランスフェクション試薬複合体を滴下ずつ加えます。

皿を揺らして均一に混ぜ、特にガラスの底面に優しく混ぜます。プレートは37度Cで24時間孵育し、4〜6時間後に培地を交換します。古い培地は吸引で取り除きます。

皿を2ミリリットルのPBSで3回、室温でそれぞれ10分間洗い流します。次に、pH 7.4のイメージングバッファーを2ミリリットル追加します。イメージングアンテナを共焦点顕微鏡のスライドホルダーに挿入し、ホルダーを事前に温めた環境チャンバーに入れます。

蠕動ポンプのチューブをイメージングディッシュホルダーに接続し、環境チャンバーを閉じます。さあ、画像診断ソフトを起動し、興味のある蛍光素のレーザーを選んでください。10-60倍の対物レンズを使って、アンテナをスキャンして細胞を特定して画像撮影を行います。

必要に応じて拡大倍率を上げ、必要に応じてフォーカス深度を調整してください。希望する解像度を選び、目的の対物レンズで単一の画像を撮影します。バッファ変更後に同じセルを移動させるために、アンテナマップに位置を記録します。

アンテナの複数の部分で同じ撮影設定で繰り返し撮影します。出口ラインだけを蠕動ポンプに接続し、皿からpH7.4のバッファーをゆっくりと吸い込み、廃棄物容器に吸い込みます。その後、入口ラインをpH 5.5のクエンチバッファーに移します。

蠕動ポンプを起動してpH 5.5バッファーを1.5ミリリットル毎分の流量で加え、セルがしっかりと付着し続けるようにします。20分後にポンプを停止し、バッファー内で細胞をさらに20分間培養して平衡させます。インキュベーション後、保存した位置の画像を繰り返し撮影します。

画像定量を開始するには、ImageJを開き解析対象画像を読み込みます。画像はスタックとして表示され、各キャプチャされたチャネルが同じフレーム内に表示されます。位相チャンネルに進みます。

画像が明るすぎる場合は、「プロセス」を選択し、コントラストを強調してから「OK」をクリックします。虫眼鏡ツールを使って1つのセルをズームインします。フリーハンド選択ツールを使って位相チャネル内のセルの輪郭をなぞります。次に、対象の蛍光分子に対応する蛍光チャネルに切り替えます。

「分析」を選択し、「セット測定」をクリックして希望する測定値を設定します。面積、平均グレー値、統合密度を必ずチェックしてください。選択した領域を測定するには、「分析」を選択し、「測定」をクリックします。

各細胞の補正済み全細胞蛍光値(CTCF)を、提供された式を用いて計算します。同じワークフローでバッファ変更後に取得した画像を解析します。すべての結果をデータ分析ソフトウェアにエクスポートし、統計処理を行います。

非トランスフェクトされたN2a細胞では弱いα-BTX AF647染色が観察され、α-7 DNAをトランスフェクトした細胞では堅牢な点状標識が検出されました。定量解析の結果、α-7 nAChRsの細胞膜発現は、α-7型質質移植されたN2a細胞で非型質感染対照群よりも有意に高いことが確認されました。pH 7.4では、細胞膜にアルファ7 pHuji蛍光が全て認められました。

トランスフェクトされたN2a細胞において。pH 5.5ではα-7 pHuji蛍光が減少し、内部受容体の局在が明らかになりました。外部α-7 pHuji受容体の蛍光が受容体の発現の大部分を占めました。

定量化の結果、α-7 pHuji受容体の82.6%が細胞膜上に、17.4%が細胞膜内に存在することが示されました。pH 7.4に戻ると蛍光が回復し、pHujiの信号可逆性が確認されました。pH 7.4では、α-4 SEPとβ-2 pHujiを発現するN2a細胞は、両サブユニットで強固な膜蛍光を示しました。

pH 5.5では蛍光が消滅され、α-4 SEPおよびβ-2 pHujiサブユニットの内部局在が示唆されました。定量化の結果、α-4 SEPの76.5%が細胞膜に、23.4%が細胞膜内に存在することが示されました。三重トランスフェクト細胞では、α-4 SEPは82.8%の膜局在と17.2%の内部発現を示しました。

同じ細胞では、β-2 pHujiサブユニットの63.4%が膜上に局在し、36.6%が細胞内に位置していました。提示されたプロトコルを用いて、ニコチン受容体の発現および輸送に対する新規のシャペロン効果を特徴づけ、新たな標的選択療法を評価する。当プロトコルの利点は、ホモマーおよびヘテロメリックニコチン受容体への適応性であり、相対的な細胞位置の定量化が可能であることです。

当社のアプローチは、ニコチン受容体形質膜の迅速な発現を可能にし、シャペロン介在の取引解析や創薬活動を支援します。