宿主-病原体相互作用を研究するためのマウス前立腺オルガノイドモデルの生成
February 27th, 2026
このプロトコルは、2Dで培養されたマウス前立腺オルガノイドモデルの生成を記述しています。この検査には、オルガノイド解離、細胞シーディング、分化、上皮の完全性評価、そして尿路病原性大腸菌による体外感染が含まれます。このモデルは頂端のアクセス性を提供し、宿主と病原体の相互作用の研究に適しており、従来の3Dオルガノイドシステムの制約を克服します。
本研究は、細菌の病原体がどのように前立腺上皮に感染し、どの宿主病原体との相互作用が感染結果を決定するかを理解することに焦点を当てています。既存のin vitroモデルは前立腺上皮の多様性を十分に捉えていませんでした。このモデルは、組織内に存在する異なる細胞タイプを反映した生理学的に関連性の高いシステムを提供します。
まず、24ウェルプレートの細胞外マトリックスの滴に三次元マウスの前立腺オルガノイドを培養します。希望の井戸数から培地を吸引し、各井戸に500マイクロリットルの新鮮培養培地を加えます。P1000ピペットを用いて、各ウェルの細胞外マトリックス滴落を機械的に破壊します。
この懸濁液は15ミリリットルの円錐管に集め、1本の管ごとに最大2本の井戸を収集してください。新鮮な培地を加えて10ミリリットルにします。チューブを優しく3〜4回逆さにして混ぜ、450Gで4度Cで5分間遠心分離します。
上清液を吸引してください。ペレットを酵素溶液2ミリリットルに再懸浮させ、37度まで予温し、37度の水浴で15分間培養します。P1000ピペットを用いて、培養中は5分ごとに細胞懸濁液を混合します。
培養後、新鮮な培地を加えて最終体積10ミリリットルにします。チューブを3〜4回優しく逆さにして混ぜます。450Gで4度Cで5分間遠心分離機を使います。
ペレットを乱さずに上澄液を吸引してください。ペレットを300マイクロリットルの培養培地に再懸浮させ、10マイクロモルのロックインヒビターを補足します。ノイバウアー計数室を使い、懸濁液中の細胞数を数えます。
懸濁液を培養培地で10マイクロモルロック阻害剤を添加した濃度に希釈し、1ミリリットルあたり62,500細胞にします。その後、48ウェルプレート用に1ウェルあたり200マイクロリットル、チャンバー式マイクロスライド用に1ウェルあたり300マイクロリットルをシードします。プレートを細胞培養インキュベーターで37度、二酸化炭素5%で培養します。
1日後、ほとんどの単細胞が二次元培養面に付着しているか確認します。培地を2〜3日ごとに交換し、7日以内に合流に達するまで培養を続けます。分化を誘導して腔内細胞を濃縮させるために、シーディング時に細胞懸濁液に5αジヒドロテストステロンまたはDHTを10ナモル添加します。
尿路病原性大腸菌株(UPEC)をLB寒天プレートにストレートし、100マイクログラム/ミリリットルのアンピシリンを補足します。プレートを37度Cで16〜24時間孵化します。滅菌ループ接種を用いて、LBブロス3ミリリットルに1ミリリットルあたり100マイクログラムのアンピシリンを補足し、単一の細菌コロニーを投与します。
培養は37度で静的に12〜16時間培養します。一晩で細菌培養を渦巻け。600ナノメートルで培養物の光学密度を測定してください。
次に、3ミリリットルのブロスで0.05の開始光学密度を達成するために必要な培養体積を計算します。計算された細菌培養液を、アンピシリンを補充した新鮮なLBブロスに加えます。37度の温度で24時間静置培養します。
培養後、細菌培養を渦巻かせます。600ナノメートルで光学密度を測定してください。光学密度を1にするために必要な培養体積を計算します。
必要な体積を12,000Gで室温で2分間遠心分離します。吸引して上清液を捨てます。細菌ペレットを1ミリリットルのプリマスとDHTなしの遊離オルガノイド培養培地に再懸濁させます。
その後、マウス前立腺オルガノイド培養培地で懸濁液を希釈し、感染の倍数を100にします。調製されたオルガノイドモデルから培養培地を吸引します。48ウェルプレートの各ウェルに、細菌を含む培地200マイクロリットを追加します。
細胞培養インキュベーターで37度、5%二酸化炭素で1時間培養します。ウェルから培地を含む細菌を吸引し、新鮮な培地でウェルを3回洗浄して細胞外細菌を除去します。次に、50マイクログラム/ミリリットルのゲンタマイシンを含む培地を加え、30分間培養します。
媒介物を吸引してください。残りの感染期間は新鮮な培地に加え、10マイクログラム/ミリリットルのゲンタマイシンを補足します。蛍光染色後に共焦点顕微鏡で感染細胞を画像化し、フローサイトメーターで感染細胞を定量します。
ジヒドロテストステロンを含まない対照条件下では、ほとんどの細胞がサイトケラチンを保持し、基底細胞が5個陽性で、CD 24 8ルミナル発現が低いのはごくわずかでした。1ナノモルDHTを補足すると混合基底腔体群が得られましたが、CD 24 Aは低く保たれました。DHTを10ナノモルに増やすことで、腔内細胞への分化を促進し、培養7日後には一部の基底細胞が維持されました。
これは、時間とともにサイトケラチンが減少し、5つの陽性基底細胞とCD-24A陽性の腔内細胞が増加し、DHT濃度が増加したことを示す定量研究と相関しました。感染後0時間で、UPECは上皮細胞に大量に付着しました。ゲンタマイシン治療を1時間行った後、UPEC陽性細胞の数が急激に減少しました。
24時間時の感染細胞数は1時間時とほぼ同じでした。24時間後の共焦点画像では、細胞内細菌が群集状のクラスターを形成し続けていることが示されました。このプロトコルにより、研究者は上皮細胞多様性を保存するモデルの中で細菌感染動態や病原体相互作用を研究できます。
今後の研究では、このモデルを用いて感染症、がん生物学など多様な前立腺疾患の調査や治療化合物の検証が期待されます。
Overview
This article presents a step-by-step protocol for generating a two-dimensional (2D) culture model derived from mouse prostate organoids. The model maintains key epithelial characteristics and allows direct access to the apical surface, enabling detailed studies of host-pathogen interactions, particularly with uropathogenic Escherichia coli (UPEC). The protocol includes organoid dissociation, cell seeding, differentiation, and infection procedures, validated by immunofluorescence and functional assays.
Key Study Components
Area of Science
- Prostate epithelial biology
- Host-pathogen interactions
- Organoid and cell culture models
Background
- Prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia, prostatitis, and prostate cancer are prevalent in aging men.
- Organoid models replicate epithelial structure and function but limit access to the apical surface.
- Existing in vitro models do not fully capture the diversity of prostatic epithelial cells.
- Improved models are needed to study infection dynamics and disease mechanisms.
Purpose of Study
- To develop a physiologically relevant 2D culture system from mouse prostate organoids.
- To enable direct experimental access to the apical surface for infection studies.
- To validate the model's epithelial diversity and suitability for host-pathogen interaction research.
Methods Used
- Dissociation of mature mouse prostate organoids cultured in extracellular matrix.
- Seeding of dissociated cells onto 2D culture surfaces with optimized conditions for attachment and proliferation.
- Differentiation induction using dihydrotestosterone (DHT) supplementation.
- Infection of the 2D model with UPEC and analysis via immunofluorescence microscopy, TEER measurements, and flow cytometry.
Main Results
- The 2D model retained essential epithelial characteristics and cellular diversity.
- DHT supplementation modulated the balance between basal and luminal cell populations.
- UPEC adhered to and invaded epithelial cells, forming intracellular clusters observed by confocal microscopy.
- Gentamycin treatment effectively reduced extracellular bacteria, allowing study of intracellular infection dynamics.
Conclusions
- The 2D organoid-derived model provides a robust platform for studying prostate epithelial biology and host-pathogen interactions.
- It enables detailed investigation of infection dynamics and cellular responses.
- The model is suitable for future studies on prostate diseases and therapeutic testing.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Prostate organoid-derived 2D models address a critical gap in preclinical research by enabling direct interrogation of host-pathogen interactions at the epithelial barrier. This system preserves cellular diversity and barrier function, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for infection and prostate disease research. The platform's translational relevance positions it as a reusable asset for portfolio-wide evaluation of disease mechanisms and therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of epithelial responses to uropathogenic Escherichia coli infection.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets in a physiologically relevant context.
- Facilitates biological de-risking by modeling both basal and luminal cell populations.
- Improves predictive confidence for downstream infection biology studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible 2D epithelial system for quantitative infection assays.
- Enables direct access to the apical surface for compound or pathogen application.
- Supports TEER and immunofluorescence-based readouts for barrier integrity and cell differentiation.
- Allows scalable preparation for high-content screening of infection-modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant epithelial biology for translational infection and prostate disease models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation of host-pathogen mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement of therapeutic hypotheses targeting epithelial infection pathways.
- Supports evaluation of candidate interventions in a system reflecting in vivo cellular diversity.
Pipeline & Workflow Integration
This organoid-based 2D model bridges early discovery and preclinical infection research, enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative readouts within a unified workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of infection mechanisms and epithelial responses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection and barrier function assays for compound evaluation.
- Analytics: Provides immunofluorescence, TEER, and flow cytometry outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Maintains disease-relevant cellular organization for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse prostate disease and infection studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in infection biology.
- Operational Value: Standardizes epithelial infection assays with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of infection and prostate disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, epithelial differentiation, and infection assays.
- Needs access to immunofluorescence microscopy, TEER instrumentation, and flow cytometry.
- Demands cross-team standardization of cell seeding, differentiation, and infection protocols.
- Adaptable to other epithelial models with protocol optimization for tissue specificity.
- Barrier function and cellular diversity must be validated for each experimental batch.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
3D Prostate Organoid Disruption into Single Cells
1:58
Plating Single-Cell Suspension onto a 2D Culture Surface
3:17
Preparation of Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) for Infecting the Organoids
5:12
Infecting the Prepared Prostate-Organoid Model with Uropathogenic Escherichia coli (UPEC)
6:16
Results
7:38
Conclusion
