クローン作成のための核ドナーとして、クローンのためにクローンを行うクライオ保存馬の精液から体細胞を分離するための簡易微小吸引技術
2025年12月19日
このプロトコルは、凍結保存された馬の精液から生存可能な体細胞(SC)を分離するための簡単なマイクロ吸引技術を提示します。従来の手法とは異なり、この技術は長時間 のin vitro 培養を避け、精子汚染を克服するため、体細胞クローニングへの即時利用を可能にします。
私たちは、低温保存された馬の精液から体細胞が遺伝的価値の高い個体を回収するのに役立つことを示すことを目指しています。現在の課題は、核ドナーとして使用するために、完全な二倍体DNAを持つ体細胞を選定することです。まず、液体窒素タンクから馬用の精液ストローを取り除きます。
空気に10秒間当て、37度の水浴で30秒解凍します。解凍した精液を250マイクロリットルのサンプルで取って。補給されたDMEM-F12培地を1ミリリットルで希釈します。
精液混合物を37度で30分間孵化します。培養した希釈液から25マイクロリットルをチューブにピペットで抽出し、DPBS975マイクロリットルにポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンを0.1ミリグラム/ミリリットルで希釈します。サスペンションを優しく混ぜます。
希釈した精液混合物は細胞採取の過程全体を通じて37度Cに保ち続けてください。顕微鏡ステージに希釈した馬の精液を入れたペトリ皿の蓋を置き、体細胞採取の準備をします。体細胞採取に適した直径のマイクロピペットを選び、機械的吸引システムに接続します。
マイクロピペットを慎重にマイクロドロップに挿入し、皿の蓋のベースに合わせます。ピペットが培養培地を吸引したら、体細胞の個別捕獲を開始します。微小滴の底部に注目してください。そこには様々な細胞形態が見えます。
マイクロピペットの先端を各体細胞の隣に位置させ、負圧で吸引します。大小に関係なく、丸い細胞や細長い細胞をすべて集めてください。10個の細胞を集めた後、皿の蓋の上面にある10マイクロリットルの微小滴に沈着させます。
収集過程全体を通じて、この微小滴内に収集された体細胞をすべて保持してください。希望の数の体細胞が採取されたら、微小滴を用いた簡単な洗浄手順を行い、精子、ゴミ、微生物汚染物質を除去します。2つ目の皿蓋を使って、体細胞を三段階で連続洗浄します。
マイクロピペットを使って体細胞を最初の滴に移し、3〜5分間沈殿させます。同じ手順で最初の滴から2滴目の滴へ細胞を移します。もう一度移し、体細胞を3滴目に置きます。
最後に、分離した体細胞を体細胞核移植用に準備されたマイクロドロップに沈着させます。マイクロ吸引技術により、3頭の種牡馬で凍結保存された馬の精液から体細胞を回収し、捕獲率は3頭の種牡馬で1時間あたり317.7から424.7細胞の範囲に達しました。3番種牡馬が最も高い収量を示しました。
サイズと形態に基づいて5つの異なる体細胞タイプが同定されました。私たちは、核ドナーとして有用である可能性のあるクライオ保存馬精液において形態と生存能力に異なる体細胞集団を特定しました。細胞は形態に基づいて選択でき、一次培養の確立は必要ありません。
私たちは、馬の精液をバルクした後、これらの細胞の生存率を向上させることに注力します。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
このプロトコルは、凍結保存された馬の精子から生存可能な体細胞を分離するマイクロアスピレーション技術を提示します。この方法は長期のin vitro 培養と精子の汚染を避け、体細胞クローン化に即座に使用することを可能にします。
主要な研究要素
科学の分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生殖生物学
背景
- 体細胞は凍結保存された馬の精子から派生させることができます。
- 生存可能な体細胞の分離はクローン化の目的にとって重要です。
- 従来の方法はしばしば長期の培養時間を伴います。
- 精子からの汚染はクローン化プロセスを妨げる可能性があります。
研究の目的
- 馬の精子から体細胞を分離する技術を示す。
- これらの細胞を高い遺伝的価値を持つ個体のクローン化に使用できるようにする。
- 選択された体細胞が二倍体DNAを完全に保持していることを確認する。
使用された方法
- 液体窒素から馬の精子ストローを解凍します。
- 37度の水浴を使用して解凍します。
- 溶解した精子をサプリメント付きDMEM-F12培地でサンプリングおよび希釈します。
- 細胞分離のためにマイクロアスピレーション技術を適用します。
主要な結果
- 生存可能な体細胞の成功的な分離。
- プロセスにおける精子汚染の低減。
- 分離された細胞のクローン化への即時使用可能性。
- 選択された細胞における二倍体DNA完全性の保存。
結論
- マイクロアスピレーション技術は体細胞分離に効果的です。
- この方法は馬における体細胞クローン化の可能性を高めます。
- 将来の応用は馬の繁殖における遺伝的回復の改善につながる可能性があります。
よくある質問
Executive Industry Relevance
Efficient recovery of viable somatic cells from cryopreserved equine semen addresses a critical bottleneck in genetic resource utilization for advanced reproductive technologies. This microaspiration technique enables immediate access to diploid donor cells for somatic cell nuclear transfer (SCNT), bypassing the need for prolonged culture and mitigating sperm contamination. The approach expands the potential for genetic rescue and portfolio diversification in animal biotechnology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of somatic cell viability and diploid status from cryopreserved samples.
- Supports functional validation of nuclear donor suitability for SCNT workflows.
- Facilitates mechanistic de-risking by allowing morphological selection of donor cells.
Screening & Assay Development
- Provides a rapid, reproducible method for isolating somatic cells free from sperm interference.
- Delivers standardized cell populations for downstream cloning assays without primary culture establishment.
- Enables quantitative assessment of cell yield and morphology for process optimization.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from genetic resource banking to preclinical cloning applications.
- Aligns with translational objectives by enabling recovery of high-value genotypes from archived material.
- Reduces biological risk by ensuring donor cell integrity prior to embryo generation.
Pipeline & Workflow Integration
This microaspiration method integrates at the interface of genetic resource recovery and SCNT-based cloning, bridging cryopreservation banking with immediate nuclear donor preparation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on donor cell viability and genetic integrity from cryopreserved sources.
- Screening: Standardizes somatic cell isolation for reproducible SCNT input.
- Analytics: Enables quantitative measurement of cell yield and morphological diversity.
- Translational Research: Connects biobanked semen to actionable cloning workflows for genetic rescue.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable protocol for diverse genetic backgrounds and archived samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in donor cell suitability and reduces mechanistic ambiguity in SCNT.
- Operational Value: Streamlines cell isolation, enhances reproducibility, and eliminates lengthy culture steps.
- Strategic Value: Enables rapid go/no-go decisions for genetic recovery projects and optimizes resource allocation.
- Portfolio Impact: Expands the range of viable genetic material for cloning and risk-adjusted breeding strategies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in micromanipulation and cell morphology assessment.
- Needs access to mechanical aspiration systems and microscopy infrastructure.
- Demands cross-team standardization for cell selection and washing procedures.
- Adaptable to various semen samples but may require optimization for different species or preservation conditions.
- Cell viability post-isolation may vary and should be monitored for SCNT readiness.
