クローン作成のための核ドナーとして、クローンのためにクローンを行うクライオ保存馬の精液から体細胞を分離するための簡易微小吸引技術
2025年12月19日
このプロトコルは、凍結保存された馬の精液から生存可能な体細胞(SC)を分離するための簡単なマイクロ吸引技術を提示します。従来の手法とは異なり、この技術は長時間 のin vitro 培養を避け、精子汚染を克服するため、体細胞クローニングへの即時利用を可能にします。
私たちは、低温保存された馬の精液から体細胞が遺伝的価値の高い個体を回収するのに役立つことを示すことを目指しています。現在の課題は、核ドナーとして使用するために、完全な二倍体DNAを持つ体細胞を選定することです。まず、液体窒素タンクから馬用の精液ストローを取り除きます。
空気に10秒間当て、37度の水浴で30秒解凍します。解凍した精液を250マイクロリットルのサンプルで取って。補給されたDMEM-F12培地を1ミリリットルで希釈します。
精液混合物を37度で30分間孵化します。培養した希釈液から25マイクロリットルをチューブにピペットで抽出し、DPBS975マイクロリットルにポリビニルアルコールまたはポリビニルピロリドンを0.1ミリグラム/ミリリットルで希釈します。サスペンションを優しく混ぜます。
希釈した精液混合物は細胞採取の過程全体を通じて37度Cに保ち続けてください。顕微鏡ステージに希釈した馬の精液を入れたペトリ皿の蓋を置き、体細胞採取の準備をします。体細胞採取に適した直径のマイクロピペットを選び、機械的吸引システムに接続します。
マイクロピペットを慎重にマイクロドロップに挿入し、皿の蓋のベースに合わせます。ピペットが培養培地を吸引したら、体細胞の個別捕獲を開始します。微小滴の底部に注目してください。そこには様々な細胞形態が見えます。
マイクロピペットの先端を各体細胞の隣に位置させ、負圧で吸引します。大小に関係なく、丸い細胞や細長い細胞をすべて集めてください。10個の細胞を集めた後、皿の蓋の上面にある10マイクロリットルの微小滴に沈着させます。
収集過程全体を通じて、この微小滴内に収集された体細胞をすべて保持してください。希望の数の体細胞が採取されたら、微小滴を用いた簡単な洗浄手順を行い、精子、ゴミ、微生物汚染物質を除去します。2つ目の皿蓋を使って、体細胞を三段階で連続洗浄します。
マイクロピペットを使って体細胞を最初の滴に移し、3〜5分間沈殿させます。同じ手順で最初の滴から2滴目の滴へ細胞を移します。もう一度移し、体細胞を3滴目に置きます。
最後に、分離した体細胞を体細胞核移植用に準備されたマイクロドロップに沈着させます。マイクロ吸引技術により、3頭の種牡馬で凍結保存された馬の精液から体細胞を回収し、捕獲率は3頭の種牡馬で1時間あたり317.7から424.7細胞の範囲に達しました。3番種牡馬が最も高い収量を示しました。
サイズと形態に基づいて5つの異なる体細胞タイプが同定されました。私たちは、核ドナーとして有用である可能性のあるクライオ保存馬精液において形態と生存能力に異なる体細胞集団を特定しました。細胞は形態に基づいて選択でき、一次培養の確立は必要ありません。
私たちは、馬の精液をバルクした後、これらの細胞の生存率を向上させることに注力します。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本プロトコルでは、凍結保存された馬精液から生存可能な体細胞を単離するためのマイクロアスピレーション法を紹介します。この手法は、長期のin vitro培養や精子の混入を回避できるため、体細胞クローニングに即座に使用することが可能です。
研究の主要構成要素
科学分野
- 神経科学
- 細胞生物学
- 生殖生物学
背景
- 体細胞は、凍結保存された馬精液から誘導することができます。
- クローニングにおいては、生存可能な体細胞を単離することが極めて重要です。
- 従来の方法では、培養に長い時間を要することがよくあります。
- 精子の混入は、クローニングプロセスを妨げる可能性があります。
研究目的
- 馬の精液から体細胞を分離する技術を実演すること。
- これらの細胞を用いて、遺伝的価値の高い個体のクローニングを可能にすること。
- 選択した体細胞が完全な二倍体DNAを保持していることを確認すること。
使用した手法
- 液体窒素から馬精液ストローを融解する。
- 融解には37 °Cの水浴を使用する。
- 融解した精液をサンプリングし、添加剤含有DMEM-F12培地で希釈する。
- 細胞分離のためにマイクロアスピレーション法を適用する。
主要な結果
- 生存可能な体細胞の分離に成功すること。
- 工程における精子の混入を低減すること。
- 分離した細胞を直ちにクローニングに使用できること。
- 選択した細胞における二倍体DNAの完全性を維持すること。
結論
- マイクロアスピレーション法は、体細胞の分離に有効です。
- この手法により、馬における体細胞クローニングの可能性が高まります。
- 今後の応用により、馬の繁殖における遺伝的回復の向上が期待されます。
よくある質問
産業上の重要性
凍結保存された馬精液から生存可能な体細胞を効率的に回収することは、高度な生殖技術における遺伝資源利用の重大なボトルネックを解消することになります。このマイクロアスピレーション技術により、長期培養の必要性を排除し、精子の混入を軽減しつつ、体細胞核移植（SCNT）のための二倍体ドナー細胞への迅速なアクセスが可能になります。この手法は、動物バイオテクノロジーのパイプラインにおける遺伝的救済およびポートフォリオ多様化の可能性を広げるものです。
バイオ医薬品研究開発における戦略的応用
初期発見およびターゲットバリデーション
- 凍結保存サンプルから体細胞の生存率および二倍体状態を直接的に確認することが可能です。
- SCNTワークフローにおける核ドナーの適合性の機能的検証をサポートします。
- ドナー細胞の形態学的選択を可能にすることで、メカニズム的なリスク低減を促進します。
スクリーニングおよびアッセイの開発
- 精子の干渉を受けずに体細胞を単離するための、迅速で再現性の高い手法を提供する。
- 初代培養の確立を介さずに、後続のクローニングアッセイに用いる標準化された細胞集団を提供する。
- プロセスの最適化に向けた、細胞回収量および形態の定量的な評価を可能にする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 遺伝資源のバンキングから前臨床クローニングへの適用までの連続性を向上させる。
- アーカイブされた材料から高価値の遺伝子型を回収することを可能にし、トランスレーショナルな目標に合致させる。
- 胚作製前にドナー細胞の完全性を確保することで、生物学的リスクを軽減する。
パイプラインおよびワークフローの統合
この微量吸引法は、遺伝資源の回収とSCNTに基づくクローニングのインターフェースに統合されており、凍結保存バンクと即時の核ドナー調製を橋渡しするものです。
- 探索生物学：凍結保存されたソースからのドナー細胞の生存率および遺伝的完全性に関する仮説検証を支援します。
- スクリーニング：再現性のあるSCNTインプットのための体細胞分離を標準化します。
- 分析：細胞収量および形態学的多様性の定量的な測定を可能にします。
- トランスレーショナルリサーチ：バイオバンクに保存された精液を、遺伝的救済のための実用的なクローニングワークフローに結びつけます。
- エンタープライズ再利用：多様な遺伝的背景およびアーカイブサンプルに適用可能な、再利用可能なプロトコルを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ドナー細胞の適合性に関する予測精度を高め、SCNTにおけるメカニズム的な曖昧さを低減する。
- 運用の価値：細胞分離を効率化し、再現性を向上させ、長時間の培養工程を排除する。
- 戦略的価値：遺伝的回復プロジェクトにおける迅速な継続・中止判断を可能にし、リソース配分を最適化する。
- ポートフォリオへの影響：クローニングおよびリスク調整済み育種戦略に利用可能な遺伝物質の範囲を拡大する。
実施上の検討事項
- マイクロマニピュレーションおよび細胞形態評価の専門知識が必要である。
- 機械的吸引システムおよび顕微鏡インフラへのアクセスが必要である。
- 細胞選択および洗浄手順に関して、チーム間での標準化が求められる。
- 様々な精液サンプルに適応可能であるが、種や保存条件によって最適化が必要な場合がある。
- 単離後の細胞生存率は変動する可能性があり、SCNTへの適応性をモニタリングすべきである。
