ペルオキシソーム特異的プローブを用いた哺乳類細胞におけるペルオキシソーム染色

そのため、私たちの研究は脂質代謝と細胞の酸化バランスに不可欠な小器官であるペルオキシソームの理解に焦点を当てています。私たちは、それらの構造や機能がどのように調節されているのか、そしてこれらのプロセスが疾患においてどのように変化するかを明らかにすることを目指しています。これを実現するために、私たちは蛍光プローブを開発し、私たちや広範な科学コミュニティがさまざまな動物細胞内のペルオキシソームを可視化できるようにしています。

ここでは、生細胞と固定細胞の両方で有効な染色プロトコルを開発し、健康および病理におけるパロキセチン生物学の研究に強力なツールを提供します。主な実験的課題の一つは、動物細胞におけるペルオキシソームの非侵襲的標識の実現です。抗体染色はこれを克服するのに役立ちますが、発作性タンパク質に対する市販の抗体は不足しています。

もう一つの課題は、ペルオキシソームを非侵襲的にリアルタイムで可視化することであり、適応可能なプロトコルが必要です。最後に、従来の染色では機能的な読み取りはできません。一方、ペルオキシダーゼを使った染色は発作機能によって異なり、これは挑戦であると同時に機会でもあります。なぜなら、細胞内の発作機能状態を区別できるからです。

前日に種付けした哺乳類の細胞を、30〜70%の合流率のカバースリップでプレートに植え付けて始めます。ペルオキシソームプローブを新しい培地で希釈し、感光性の高いマイクロ遠心分離管内で最終濃度を4マイクロモルにします。外側にマーカーペンで塗る目的の穴を選び、ラベルを付けます。

選択した井戸から0.5ミリリットルの媒体を吸引し、井戸壁に沿って一滴ずつ準備済みのプローブ媒体に置き換えます。投与後、細胞を37度の温度で10〜15分間培養します。ここから先はアルミホイルでセルを光から遮ります。

培養後は、染色された培地を慎重に除去し、細胞をPBSで2回洗浄します。次に、プレートを化学フードの下に置き、PBS中のパラホルムアルデヒド4%を加え、室温で20分間培養します。固定後、パラホルマルデヒドを指定された廃棄容器に取り出し、細胞をPBSで一度洗浄します。

次に、PBSに0.5%トリトンXを加えて細胞を透過させ、2.5分間培養します。培養後、トリトンXを取り出し、細胞をPBSで2回10分間洗浄します。細胞をブロックするために、PBSで5%の牛血清アルブミンを4度Cの温度で一晩培養します。

標準プロトコルに従って免疫蛍光染色手順を行います。最後に、顕微鏡検査を行い、固定細胞と生細胞の両方の画像を取得します。Peroxi_SPYプローブを用いた生細胞染色により、ATP結合カセットサブファミリーD依存性のペルオキシソームへの導入が可能となり、代謝活性細胞において高いペルオキシソームと細胞質の蛍光比が生じました。

GFP-SKLを発現する野生型HEK-293T細胞では、Peroxi_SPY555染色はペルオキシソームと明確に共局在を示した一方、ペルオキシソームを欠くPEX19ノックアウト細胞では染色が見られませんでした。ヒト線維芽細胞では、Peroxi_SPY染色が発作マーカーであるGFP-SKLと共局所し、ペルオキシソーム標的化が確認されました。ペルオキシソーム密度の定量により、異なる細胞タイプ間で有意な差異があることが明らかになりました。

COS-7細胞において250ナノモルPeroxi_SPYを20分間最適化した染色条件により、従来の1マイクロモル10分間プロトコルと比較して、ペルオキシソームと細胞質の蛍光比が大幅に向上しました。HEK-293T細胞をPeroxi_SPYで24時間長時間培養した結果、ペルオキシソーム染色が減少したにもかかわらず、15分と比べてペルオキシソームと細胞質の蛍光強度比が改善されました。固定プロトコルにより、HuH-7およびHEK-293T細胞における保存されたPeroxi_SPY標識および抗PEX14免疫染色によって抗体染色が成功することが実証されました。

定量化の結果、固定および透過化手順は生細胞染色と比較してペルオキシソーム蛍光強度に影響を与えることが示されました。私たちは、生細胞および固定された動物細胞の両方でペルオキシソームを可視化できるPeroxi_SPY染料を開発しました。当社の蛍光プローブは、これまで限られていた過酸化物体動態、異質性、機能障害を簡単かつ迅速に研究する方法を提供します。

このプロトコルにより、発作性疾患を持つ患者由来細胞を含む多様な細胞タイプにおける画像診断に基づくペルオキシソーム研究が可能になります。