一次ヒト気道上皮培養における蛍光ベースのカルシウムイメージング(自動細胞分割法による)

単細胞トランスクリプトミクスは嚢胞性線維症気道上皮の異質性を明らかにしています。細胞型特異的な機能や変化が疾患の病因にどのように影響するかを理解することを目指しています。現在の課題は、単一細胞プロテオミクスと機能を正確に測定することです。

これはまだ技術的な開発が必要です。まず、Calu-3細胞をEagle's Minimum Essential Media Culture Media(最小限培地培養培地)に20%FBSおよび1%ペニシリンストレプトマイシンを補足したT-25フラスコに保持します。細胞が約70%のコンフルレンスに達したら、PBSを5ミリリットルで洗浄します。

洗浄後、細胞に直接1ミリリットルのTrypLEを加え、フラスコを37度C、5%二酸化炭素に設定されたインキュベーターに10〜15分間入れます。次に、4ミリリットルの新鮮な完全培養培地を加えてTrypLEを中和し、細胞懸濁液を十分に混合します。セルを96ウェルのプレートに約90%から100%のコンフルエンスでプレートし、1ウェルあたり約40,000セルに相当します。

セルが96ウェルプレートに一晩密着するのを待ちます。培地は毎日交換し、コンフルエンシー後2〜5日間は細胞を培養して分化を促します。実験当日にはCalu-3細胞を洗浄し、適切な染料で培養します。

次に、1ウェルあたり100マイクロリットルの2.5ミリモラープロベネシドをカルシウムバッファーで希釈して添加し、染色料を細胞質空間内に保ち、画像診断まで光から保護するためにアルミホイルで包みます。一次気道細胞のために。トランスウェルから基底外側培地を取り出し、頂端側を300マイクロリットルのカルシウムバッファーを加えて洗浄します。

次に、基底外側を750マイクロリットルのカルシウムバッファーを加えて洗浄します。ピペットでバッファーを取り出し、両面でもう一度洗いを繰り返します。次に、細胞を先端側に200マイクロリットル、基底側に600マイクロリットルの染料溶液を37度・5%二酸化炭素で1時間培養します。

孵化中はカルシウムバッファーで希釈したタプシガルギンを中間株の3倍として準備します。濃度を6マイクロモルに調整すると、井戸内の最終濃度は2マイクロモルになります。培養後、ピペッティングで頂端および基底側両区画から染料溶液を除去します。

細胞を先端側に300マイクロリットルのカルシウムバッファー、基底側側に750マイクロリットルのカルシウムバッファーで2回洗浄します。その後、ピペッティングでバッファーを取り除きます。次に、2.5ミリモラープロブネシドをカルシウム緩衝液に浸した100マイクロリットルを頂端区画に加え、同じ溶液を基底側区画に500マイクロリットル加えます。

トランスウェルインサートをプレート内に収め、光から保護するために全板をアルミホイルで包み、包んだプレートをイメージングのために脇に置きます。フィジーの申請を開いてください。ファイルを選択し、「開く」を選択して動画ファイルをアップロードします。

結果として表示されたポップアップウィンドウでは、すべてのデフォルト設定を保持し、選択を確認します。必要に応じて、画像を選択し、調整を選び、明るさコントラストをクリックして画像表示を調整してください。個々の蛍光チャネルの明るさとコントラストを調整し、細胞の最適な観察を実現します。

セルトレースを容易にするために、画像を選択し、カラーを選択し、「チャネルを統合」をクリックしてチャンネルを統合します。ポップアップウィンドウで、各チャンネルに適切なファイルを割り当て、選択を確認します。トレースでは「分析」→「ツール選択」を選択し、ROIマネージャーを開きます。

結果として表示されるポップアップウィンドウで、「全て表示」と「ラベル表示」の両方を有効にしてください。フリーハンド選択ツールを使い、細胞境界と核染色に基づいて個々の細胞を慎重になぞります。次にTキーを押して、トレースした各セルをROIリストに追加します。

視界の四隅すべてとビデオの中央にセルがトレースされていることを確認してください。すべてのセルが正確に追跡されたら、ROIマネージャーのウィンドウ内で「その他」をクリックし、「マルチメジャー」を選択します。結果として表示されたポップアップウィンドウで、測定を開始するためにOKを押してください。

フィジーでビデオファイルを開いてください。核蛍光チャンネルと緑色蛍光チャンネルを画像調整ツールで最適化して視聴します。チャネルが最適化されたら、画像を選択し「複製」を選択して1フレームを複製します。

結果としてポップアップウィンドウで「複製スタック」を選択し外し、複製した画像をPNG画像ファイルとして保存します。画像を選択し、「複製」を選択して、もう一方のチャンネルのフレーム複製を繰り返します。ポップアップウィンドウでOKを押し、画像を保存するとPNGファイルになります。

保存した2つの画像を統合するには、画像を選択し、カラーを選択し、「チャンネルを統合」をクリックしてください。次に、各PNGファイルを適切なチャンネルに割り当て、マージを確認します。結合した画像をセルのポストグラフィカルユーザーインターフェースにアップロードし、セルマスクを生成します。

画像をセグメント化し、核染色をチャンネル1にし、細胞質染色をチャンネル2に割り当てます。cyto3モデルを選択して画像を分割します。次に、生成されたマスク画像をPNGファイルとして保存します。フィジーで開いてTIFFファイルに変換してください。

さらに、Cal-520 AMを負荷した細胞では、カルシウム依存性蛍光活性化が有意に高かった。機械学習に基づく解析により、1,441個体の細胞でカルシウム依存性蛍光変化を単一の視野から特定・定量化しました。ソフトウェアによって生成された正規化された蛍光痕跡は、タプシガルギン刺激後の1,441個の特定細胞すべてでカルシウム応答を示しました。私たちの研究は、異なる細胞型が環境に応答する様子を理解するのに役立ち、標的治療薬の開発にも寄与します。

私たちの発見は、異なる細胞タイプに絞り込み、環境刺激に対する特定の生細胞応答を割り当てる可能性を秘めています。将来的には、疾患や健康細胞における細胞型特異的シグナル伝達がどのように変化するかを探求し、どのタイプが原因かを明らかにする予定です。