マウスの頸部リンパ管およびリンパ流の収縮率を生 体内 で2光子イメージングするための再現可能なセットアップ

マウスにおける子宮頸リンパ管収縮性と赤血球のリンパ除去の新たな画像診断の必要性を提示します。頸部リンパ管の機能を研究することは困難であり、特にリンパ流やトレーサー循環の収縮性を長期的に観察する必要がある場合には困難です。まず、長さ270ミリ、幅43ミリの鋼製光学レールを装置のベースに置きます。

スチール製光学レールの上に2つの柱ホルダーを設置し、175ミリメートルの間隔を確保します。直径12ミリの取り付けポストを2本ポストホルダーに差し込み、それぞれM6ネジで固定します。次に、2本の取り付けポストそれぞれに柱の襟を取り付けます。

直角の固定柱クランプを取り付け、M6ネジでしっかりと固定します。直角ポストクランプの側面穴に12ミリの取り付けポストを挿入します。挿入された側面取り付けポストに3Dプリントされたホルダーを取り付け、2対のM3ネジでしっかりと固定します。

UV硬化可能な接着剤を使い、直径12ミリのカバーガラスを保護用3Dプリントケースの裏側に貼り付けます。その後、保護ケースをM4ネジ/ナットペアで3Dプリントされたホルダーに固定します。2つのテーブルクリップとM6ネジ、ナット、ワッシャーのセットを使って、スチール製光学レールベースに垂直移動用の精密パンタグラフテーブルを設置します。

次に、長さ155ミリ、幅110ミリの3Dプリントケースをテーブルの上に置きます。このケースは生理食塩水を蓄積するための貯蔵庫として機能します。配線と加熱素子1の接続点を薄いシリコン層で覆います。

温度センサー1をマットに固定し、シリコンで密封します。加熱素子と温度センサーの配線を多線ケーブルにハンダ付けします。接続部をシリコンで満たし、シュリンクラップで閉じます。

ヒーター2と温度センサー2をフォームローラーに入れます。電源ケーブルのコネクタと電源ボタンをコントロールユニットケースの壁に固定してください。エンクロージャー内に24ボルト直流電源、直流降圧コンバータ、そして2つのMOSFETモジュールを設置してください。

回路を組み立て、必要な部品をはんだ付けした後、Arduino Unoとキーボードの画面を蓋のハウジングに固定します。温度選択フィールドを見つけてください。温度を調整してプレスランをしてください。

麻酔後、手術中の眼球乾燥を防ぐために両まぶたに眼軟膏を塗布します。後肢の引き込み反射と尾をたむ反射がなくなったら、マウスを加熱要素の上に仰向けに置き、腹部へのアクセスを確保します。制御ユニットを入力電圧175〜240ボルトの交流電源コンセントに接続します。

医療用テープを使い、動物の体をテーブルの表面と平行な位置に固定し、頭部を矢状軸に対して角度をつけて首の片側がローラーに乗るようにします。上切歯に結びつけて機器の背面に固定し、医療用テープを使って動物の体温を保ちます。次に、首の部分の毛を剃ります。

残った抜け毛を取り除き、動物を覆って無菌フィールドを保ちます。一次消毒では、アルコール綿棒を使って首の皮膚を消毒してください。その後、0.5%クロルヘキシジン溶液または2%ヨウ素溶液を消毒用に塗布し、消毒をさらに2回繰り返します。

足のつまみ反射で麻酔の深さを確認した後、下顎から鎖骨までの首の皮膚に沿って約2センチメートルの長さの縦切開をして皮膚切開を行います。その後、顕微外科的湾曲ハサミを用いた筋膜切開を行います。曲がったピンセットを使って、唾液腺や浅い首の筋肉をそっと押しのけて胸鎖乳突筋を露出させます。

目に見える血管が損傷しないようにし、組織損傷を防ぐために生理食塩水で手術部位を継続的に湿らせてください。顕微外科的はさみを使って胸鎖乳突筋の筋切開を行い、気管と頸動脈の間の領域にアクセスします。筋肉と筋膜の広げを続け、筋膜切開と筋膜切開の両方を行います。

次に、深部頸部リンパ節と、5〜7ミリメートルの深さにある求心性および遠心性リンパ管を特定します。固定された動物を固定する装置を可動顕微鏡テーブルに置きます。また、M6ネジでしっかりと固定して、撮影中の安定性を確保します。

生理食塩水であらかじめ充填されたカテーテルを医療用テープで取り付けポストに取り付けます。動物の頭部側面の加熱要素の下に直径1センチのローラーを置き、顕微鏡テーブルに対して45度の傾きを保ちます。次に、固定カテーテルを手術で開いた首部に位置し、動物の鎖骨付近に位置させ、生理食塩水を作動させて開いた首の腔に生理食塩水を充填します。

生理食塩水で満たされた首の部分に保護ケースを下ろし、リンパ管が視野の中心に位置するようにします。その後、圧力をかけずに保護カバーを気管に当てます。最後に、非水浸しの二光子レンズを保護ケース内にレンズの作業距離に基づく適切な深さまで下ろし、頸部リンパ管の二光子可視化を行います。

手術後、組織内のエバンスブルーリンパ節の蓄積により、深部頸部リンパ節の同定が確認されました。光生体調節の前後に、頸部リンパ管の収縮力の二光子モニタリングが行われました。光生調節は、2か月および18か月のマウスで同様の強度で頸部リンパ管の収縮力を有意に増加させました。

定量解析により、24か月マウスの頸部リンパ管収縮率は2か月および18か月のマウスに比べて有意に低いことが示されました。しかし、2か月と18か月のマウスの間で値は有意な差はありませんでした。フォトバイオモジュレーションは2か月および18か月のマウスで頸部リンパ管の収縮率を有意に増加させましたが、24か月のマウスには効果がありませんでした。

右側心室に注入された赤血球は、注射から4時間後に頸部リンパ管内に観察され、5時間経過後も内腔内を通過し続け、脳から末梢への方向性の流れが確認されました。当プロトコルは、子宮頸リンパ管の機能を生体内でモニタリングしつつ、最大5時間の観察期間にわたり収縮力を維持します。この方法は再現性が高く、さまざまな二光子顕微鏡や対物レンズと互換性があり、最大500マイクロメートルの深さで高品質な画像を維持します。

この技術は、脳排液系の生理学や頸部リンパ管の機能を研究するための普遍的なツールとなる可能性があります。