骨再生と足場性能を評価するマルチモーダルアプローチ

私たちの研究は、再生過程における異なるバイオマテリアルが骨構造にどのように影響を与えるかを評価しています。骨再生は組織が階層的に組織的に組織されるため、多スケール評価が必要です。このプロトコルにより、異なるスケールでの試料の分析が可能になります。

まず、樹脂で埋め込まれた生体材料を含む脛骨を標本ホルダーに固定し、器具アームに取り付けます。サンプルを目的の区切方向に配置します。低速ダイヤモンドソーディスクを入手し、骨を約0.7ミリメートルのスライスに分割します。

液体タンクに液体のレベルが刃の底端を完全に覆うまで満たします。サンプルが安定し、ディスク表面と水平に整列していることを確認してください。標本の位置を調整し、ターゲットカット領域が刃と一致するまで調整します。

試料を高速で切断し、低圧で凹みができるまで続けます。その後、速度を落としてセクション作業をスムーズに完了し、振動を最小限に抑えます。切断が終わったらすぐにノコギリを止めてください。

その後、立体顕微鏡で切断サンプルを調べてマウントします。取り付けには、内側に一枚のソリッドステンレス製シリンダーと、外側に中空シリンダーを組み合わせた自作アセンブリを使用し、研磨時に機械的サポートを提供します。次に、内側のシリンダーをホットプレートに置き、約120度から140度まで加熱します。

適切なワックスを選び、加熱した円筒の表面に少量のワックスを塗り、完全に溶かします。次に、サンプルを目的の表面を下に向けてワックスコーティングされた部分に置き、溶けたワックスと完全に接触するように優しく押します。次に、アルミシリンダーをホットプレートから外し、ワックスを室温で固めます。

粗研磨および中間研磨には、1、200、2、500、4,100の砂をかけて試料の厚さを約0.15ミリメートルに減らします。まず1,200番のサンドペーパーから始め、次に2,500番のサンドペーパーを軽く加えながら使います。研磨中は反射顕微鏡を用いて定期的に試料の厚さを監視してください。

目標の厚さに達したら、4枚の100番サンドペーパーで試料の両面を研磨します。研磨の各段階では蒸留水で継続的に試料を洗浄してください。最終研磨には、試料の表面粗さに基づいて6マイクロメートルまたは3マイクロメートルの粒径のダイヤモンドペーストを選びます。

フェルトの研磨クロスに少量のダイヤモンドペーストを塗り、研磨ディスクに取り付けてサンプルを研磨します。試料をシリンダーから外すには、熱いプレートでワックスを温めてください。ユニットをホットプレートから外した後、シリンダーからサンプルを取り出します。

次に、最小限の圧力でサンプルの両面を優しく研磨し、フィルターペーパーで磨かれた表面を乾燥させます。顕微鏡分析の前に、浸漬油を埋め込み媒体としてガラススライドとカバースリップの間に試料を取り付けます。偏光顕微鏡を用いてコラーゲン繊維の配向を調べ、5倍から10倍の低倍率から始めます。

最後に、走査型電子顕微鏡検査のためにサンプルを準備し、骨と生体材料の界面をさらに解析します。研磨と初期光学顕微鏡検査の後、光学顕微鏡で特定された領域をマイクロコンピュータ断層撮影データセット内の対応位置と一致させるための固有のサンプル特徴が認められました。偏光顕微鏡で、青色で示された既存の骨と、オレンジで描かれた新たに形成された骨を区別しました。

高倍率偏光顕微鏡では、骨が既存の皮質骨に密接に反対して成長し、タイプIコラーゲン線維が薄い領域に垂直に配置されていることが明らかになりました。走査型電子顕微鏡イメージングにより、関心のある領域の正確な位置特定が可能となりました。選択領域の体積はスライス・アンド・ビュー断層撮影を用いてさらに調査されました。

溝の面には成長する小柄に骨の形態が見られました。透過電子顕微鏡は骨と生体材料の界面をナノスケールで観察し、選択的な領域電子回折と組み合わせることが可能です。選択された領域電子回折パターンは、生体物質領域と骨領域の両方がヒドロキシアパタイト結晶で構成されていることを示しました。

エネルギー分散型X線分光法によるインターフェース領域のマッピングでは、リンとカルシウムが確認されました。このマルチモーダルワークフローは、単一の画像技術では得られない補完的な洞察を提供します。このワークフローには、多大な時間、技術的専門知識、そして専門的な計測機器へのアクセスが必要です。

機能的相関関係、長期的な骨再構築、バイオマテリアル設計の調査が可能です。