Name: 光学光子再割り当て を用いた回転円 板共焦点によるDNA-PAINTによる全セル超分解能イメージング (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-06T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: 学ぶ光学光子再割り当てを用いた回転円板共焦点顕微鏡によるDNA-PAINTイメージング手法。特殊光学系不要で全細胞の単一分子局在顕微鏡を実現し、神経科学における高分解能細胞構造解析に応用可能です。

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<ol><li>Lelek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Methods+Primers%22%5BJournal%5D)">Single-molecule localization microscopy.</a> Nat Rev Methods Primers. 1 (1), 39(2021).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-substrate+contacts+illuminated+by+total+internal+reflection+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell-substrate contacts illuminated by total internal reflection fluorescence.</a> J Cell Biol. 89 (1), 141-145 (1981).</li>
<li>Tokunaga, M., Imamoto, N., Sakata-Sogawa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+thin+illumination+enables+clear+single-molecule+imaging+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Highly inclined thin illumination enables clear single-molecule imaging in cells.</a> Nat Methods. 5 (2), 159-161 (2008).</li>
<li>Vignolini, T., Capitanio, M., Caldini, C., Gardini, L., Pavone, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+inclined+light+sheet+allows+volumetric+super-resolution+imaging+of+efflux+pumps+distribution+in+bacterial+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly inclined light sheet allows volumetric super-resolution imaging of efflux pumps distribution in bacterial biofilms.</a> Sci Rep. 14 (1), 12902(2024).</li>
<li>Kim, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oblique-plane+single-molecule+localization+microscopy+for+tissues+and+small+intact+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Oblique-plane single-molecule localization microscopy for tissues and small intact animals.</a> Nat Methods. 16 (9), 853-857 (2019).</li>
<li>Ghosh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+the+molecular+interplay+of+CD20+and+therapeutic+antibodies+with+fast+volumetric+nanoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Decoding the molecular interplay of CD20 and therapeutic antibodies with fast volumetric nanoscopy.</a> Science. 387 (6730), eadq4510(2025).</li>
<li>Wäldchen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole-Cell+imaging+of+plasma+membrane+receptors+by+3D+lattice+light-sheet+d+STORM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Whole-Cell imaging of plasma membrane receptors by 3D lattice light-sheet d STORM.</a> Nat Commun. 11 (1), 887(2020).</li>
<li>Zagato, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabricated+devices+for+single+objective+single+plane+illumination+microscopy+%28SoSPIM%29%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+express%22%5BJournal%5D)">Microfabricated devices for single objective single plane illumination microscopy (SoSPIM).</a> Opt express. 25 (3), 1732-1745 (2017).</li>
<li>Galland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+high-and+super-resolution+imaging+using+single-objective+SPIM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D high-and super-resolution imaging using single-objective SPIM.</a> Nat Methods. 12 (7), 641-644 (2015).</li>
<li>Pawley, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPawley%2C+J+%22Handbook+of+biological+confocal+microscopy%22">Handbook of biological confocal microscopy</a>. 236, Springer Science & Business Media. (2006).</li>
<li>Schueder, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+super-resolution+imaging+of+whole+cells+using+spinning+disk+confocal+microscopy+and+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D super-resolution imaging of whole cells using spinning disk confocal microscopy and DNA-PAINT.</a> Nat Commun. 8 (1), 2090(2017).</li>
<li>Azuma, T., Kei, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+spinning-disk+confocal+microscopy+using+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Opt+Express%22%5BJournal%5D)">Super-resolution spinning-disk confocal microscopy using optical photon reassignment.</a> Opt Express. 23 (11), 15003-15011 (2015).</li>
<li>York, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instant+super-resolution+imaging+in+live+cells+and+embryos+via+analog+image+processing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Instant super-resolution imaging in live cells and embryos via analog image processing.</a> Nat Methods. 10 (11), 1122-1126 (2013).</li>
<li>Zaza, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+imaging+in+whole+cells+and+tissues+via+DNA-PAINT+on+a+spinning+disk+confocal+with+optical+photon+reassignment%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Super-resolution imaging in whole cells and tissues via DNA-PAINT on a spinning disk confocal with optical photon reassignment.</a> Nat Commun. 16 (1), 4991(2025).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+kinetics+and+super-resolution+microscopy+by+fluorescence+imaging+of+transient+binding+on+DNA+origami%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Single-molecule kinetics and super-resolution microscopy by fluorescence imaging of transient binding on DNA origami.</a> Nano Lett. 10 (11), 4756-4761 (2010).</li>
<li>Schnitzbauer, J., Strauss, M. T., Schlichthaerle, T., Schueder, F., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Super-resolution+microscopy+with+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Super-resolution microscopy with DNA-PAINT.</a> Nat Protoc. 12 (6), 1198-1228 (2017).</li>
<li>Thevathasan, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+pores+as+versatile+reference+standards+for+quantitative+super-resolution+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Nuclear pores as versatile reference standards for quantitative super-resolution microscopy.</a> Nat Methods. 16 (10), 1045-1053 (2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+3D+cellular+super-resolution+imaging+with+DNA-PAINT+and+Exchange-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multiplexed 3D cellular super-resolution imaging with DNA-PAINT and Exchange-PAINT.</a> Nat Methods. 11 (3), 313-318 (2014).</li>
<li>Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+nanometer+localization+analysis+for+individual+fluorescent+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes.</a> Biophys J. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li>
<li>Ober, R. J., Ram, S., Ward, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+accuracy+in+single-molecule+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Localization accuracy in single-molecule microscopy.</a> Biophys J. 86 (2), 1185-1200 (2004).</li>
<li>Tetley, R., Vaughan, A., Zaza, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTetley%2C+R+%22NIS-Elements+JOB+for+DNA-Paint+Acquisition+at+Serial+Z-Planes%22">NIS-Elements JOB for DNA-Paint Acquisition at Serial Z-Planes</a>. , (2025).</li>
<li>Endesfelder, U., Malkusch, S., Fricke, F., Heilemann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+estimate+the+average+localization+precision+of+a+single-molecule+localization+microscopy+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A simple method to estimate the average localization precision of a single-molecule localization microscopy experiment.</a> Histochem Cell Biol. 141, 629-638 (2014).</li>
<li>Schlichthaerle, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+visualization+of+single+nuclear+pore+complex+proteins+using+genetically-encoded+probes+for+DNA-PAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem%22%5BJournal%5D)">Direct visualization of single nuclear pore complex proteins using genetically-encoded probes for DNA-PAINT.</a> Angew Chem. 131 (37), 13138-13142 (2019).</li>
<li>Stehr, F., Stein, J., Schueder, F., Schwille, P., Jungmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flat-top+TIRF+illumination+boosts+DNA-PAINT+imaging+and+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Flat-top TIRF illumination boosts DNA-PAINT imaging and quantification.</a> Nat Commun. 10 (1), 1268(2019).</li>
<li>Jungmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+super-resolution+imaging+with+qPAINT%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Quantitative super-resolution imaging with qPAINT.</a> Nat Methods. 13 (5), 439-442 (2016).</li>
<li>Whelan, D. R., Bell, T. D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Image+artifacts+in+single+molecule+localization+microscopy%3A+why+optimization+of+sample+preparation+protocols+matters%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Image artifacts in single molecule localization microscopy: why optimization of sample preparation protocols matters.</a> Sci Rep. 5 (1), 7924(2015).</li>
<li>Xie, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+microtubule+ultrastructure+based+on+single-molecule+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of microtubule ultrastructure based on single-molecule localization microscopy.</a> Cytoskeleton. , (2025).</li>
<li>Steen, P. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA-PAINT+palette%3A+A+comprehensive+performance+analysis+of+fluorescent+dyes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">The DNA-PAINT palette: A comprehensive performance analysis of fluorescent dyes.</a> Nat Methods. 21 (9), 1755-1762 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore-DNA+labels+for+super-resolution+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore-DNA labels for super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Phys Chem B. 128 (28), 6751-6759 (2024).</li>
<li>Kessler, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-quenched+fluorophore+dimers+for+DNA-PAINT+and+STED+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Self-quenched fluorophore dimers for DNA-PAINT and STED Microscopy.</a> Angew Chem Int Ed. 62 (39), e202307538(2023).</li>
<li>Chung, K. K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorogenic+DNA-PAINT+for+faster%2C+low-background+super-resolution+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fluorogenic DNA-PAINT for faster, low-background super-resolution imaging.</a> Nat Methods. 19 (5), 554-559 (2022).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>(&plusmn;)-6-ヒドロキシ-2,5,7,8-テトラメチルクロマン-2-カルボン酸</td><td>メルク&nbsp;</td><td>238813-5G</td><td>トロロックス</td></tr><tr><td>3,4-ジヒドロキシベンゾン酸&nbsp;</td><td>メルク&nbsp;</td><td>37580-25G-F</td><td>PCA</td></tr><tr><td>60回以上;Apo NA 1.49 対物レンズ</td><td>ニコン</td><td></td><td></td></tr><tr><td>7.0 KDAスピン脱塩カラム(サイズ排除樹脂を含む&nbsp);</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社</td><td>89882</td><td>ステップ2.4のZebaスピン脱塩カラム</td></tr><tr><td>アキュターゼ - 酵素細胞剥離培地</td><td>プロモセル</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>アルパカsdAb(1H1)抗GFPとカスタムDNA結合(sdAB-5'-TCCTCCTCCTCCT-3')</td><td>マッシブフォトニクス</td><td>カスタム製品</td><td>ショウジョウバエに対するアンチGFPナノボディ</td></tr><tr><td>アルパカsdAb(1H1)抗GFPとDNA結合</td><td>マッシブフォトニクス</td><td>MASSIVE-TAG-Q-FAST アンチGFP - F3</td><td>NUP用のアンチGFPナノボディ</td></tr><tr><td>抗αチューブリン(YL1/2)</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>MA1-80017</td><td></td></tr><tr><td>抗ウサギIgG</td><td>マッシブフォトニクス</td><td>Massive-sdAB-FAST 2-Plex、セカンダリSDAB F2</td><td></td></tr><tr><td>反TCR&zeta;(6B10.2)</td><td>バイオレジェンド</td><td>644102</td><td></td></tr><tr><td>牛血清アルブミン</td><td>メルク&nbsp;</td><td>A4503-10G</td><td>BSA</td></tr><tr><td>円錐形遠心管 15 mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社</td><td>17705004</td><td></td></tr><tr><td>円錐形遠心管 50 mL</td><td>VWRインターナショナル</td><td>734-0448</td><td></td></tr><tr><td>CSU-W1 SoRa</td><td>ニコン</td><td></td><td>SDC-OPR顕微鏡</td></tr><tr><td>スピンカラムの脱塩はSephadex G-25(DNA精製のためのサイズ除外樹脂)&nbsp;</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社</td><td>11743309</td><td>ブランド:シティバ。ステップ2.5のG-25列</td></tr><tr><td>D-グルコース</td><td>メルク&nbsp;</td><td>G8270-1KG</td><td></td></tr><tr><td>DMEMメディア</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMSO、無水</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>DTT&nbsp;(ジチオスレイトール)</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15976082</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>マーク</td><td>324626</td><td></td></tr><tr><td>胎児用牛血清</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A5256701</td><td></td></tr><tr><td>グルターアルデヒド</td><td>セルヴァ</td><td>2311402</td><td></td></tr><tr><td>グリセロール</td><td>メルク&nbsp;</td><td>G5516-500ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>グリシン</td><td>MPバイオメディカル</td><td>219482580</td><td></td></tr><tr><td>マレイミド-PEG2-スクシンニミジル&nbsp;</td><td>メルク&nbsp;</td><td>746223-50MG</td><td></td></tr><tr><td>マッコイの5Aメディア</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社</td><td>16600082</td><td></td></tr><tr><td>MES(2-(N-モルフォリノ)エタンスルホン酸)</td><td>メルク</td><td>M3671-50G</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社</td><td>32213-25L</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社</td><td>10418464</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機チューブ 0.5 mL</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社</td><td>11508232</td><td></td></tr><tr><td>マイクロ遠心分離機チューブ 1.5 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>10509691&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>マイクロボリュームUV-Vis分光光度計</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>ND-ONE-W</td><td>ナノドロップ</td></tr><tr><td>NaCl2</td><td>シグマ・オルドリッチ</td><td>S6546-1L&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ナノ粒子 90 nm -金</td><td>細胞診断</td><td>G-90-100</td><td></td></tr><tr><td>Orca Fusion-BT CMOS カメラ</td><td>浜松</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ペニシリン・ストレプトマイシン</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>15070063</td><td>P/S</td></tr><tr><td>リン酸塩緩衝生理食塩水(1x溶液)</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社</td><td>11530546</td><td>PBS</td></tr><tr><td>ピアス 16% ホルムアルデヒド(w/v)、メタノールフリー</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社</td><td>11586711</td><td>PFA(顔色発射法)</td></tr><tr><td>塩化カリウム&nbsp;</td><td>メルク&nbsp;</td><td>&nbsp;P9541-500G</td><td></td></tr><tr><td>プロトカテチュアート3,4-ジオキシゲナーゼおよびnbsp;</td><td>メルク&nbsp;</td><td>P8279-25UN&nbsp;</td><td>PCD</td></tr><tr><td>ナトリウム&nbsp;水酸化物</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック社</td><td>12963614</td><td></td></tr><tr><td>TOM20抗体</td><td>アブカム</td><td>Ab186735</td><td></td></tr><tr><td>トリスバッファ</td><td>VWRインターナショナル</td><td>A4577.1000</td><td></td></tr><tr><td>トリトン&nbsp;X-100&nbsp;&nbsp;</td><td>VWRインターナショナル</td><td>1086031000</td><td></td></tr><tr><td>トゥイーン-20</td><td>メルク&nbsp;</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>超外ろ過遠心ろ過装置、100 kDa MWCO</td><td>メルク&nbsp;</td><td>UFC510024</td><td>製造元:アミコン・ウルトラ</td></tr><tr><td>&mu;-スライド 8井戸 高ガラス底</td><td>イビディ</td><td>IB-80807</td><td></td></tr><tr><td>&mu;-スライド VI 0.5 ガラス底</td><td>イビディ</td><td>IB-80607</td><td></td></tr></tbody></table>

光学光子再割り当て を用いた回転円 板共焦点によるdna-paintによる全セル超分解能イメージング

Whole-cell Super-Resolution Imaging via DNA-PAINT on a Spinning Disk Confocal with Optical Photon Reassignment

SDC-OPRシステムの超分解能イメージング能力(図1A)を示すため、核孔複合体(NPC)に対するDNA-PAINTイメージング実験(図1B)を用いて面内分解能を評価しました。NPCは生物学的基準構造です17。 図1C は、U2OS細胞におけるヌクレオポリン96(Nup96)の代表的なDNAペイントSDC-OPR画像を示しており、単量体強化緑色蛍光タンパク質(mEGFPs)で標識され、DNA結合した抗GFPナノボディで標識されています。ズームインパネルではNUPのサブ構造が明らかになり、 図1D は核孔の予想される8対称性に一致するNup96タンパク質(矢印で示される)を示しています。 図1Eでは、Nup96ペア間のユークリッド距離を、合わせて合計画像(n=16ペア)の断面ヒストグラムをプロットすることで測定しました。解析の結果、ピーク間で(13 ± 2)nmの分離が示され、これはEMモデルやHILO、TIRイメージング23の結果と一致しました。各ピークフィットは標準偏差4nmを示し、SDC-OPRでDNA-PAINTを用いて達成された高い局在精度(σSMLM = 3.3 nm、NeNA = 4.4 nm)を裏付けました。特筆すべきは、この精度が53 × 53 μm² FOV全体にわたって維持され、共焦点ベースのシステムとしては例外的である点です。
多色イメージングの能力を示すために、U2OS細胞内のNup96、ミトコンドリア、微小管をDNA標識し、Exchange-PAINT18を用いて取得しました。この技術は、単一の蛍光色素に直交するDNAイメージャーの鎖を用い、すべてのターゲットを同じレーザー源で励起させることを可能にします(図2A)。信号を同時に取得するのではなく、連続したイメージングラウンドに分けることで、商用SDC-OPRシステムへの統合を容易にします。 図2B は、抗GFPナノボディで標識された青色のNup96、赤色のミトコンドリアに二次抗TOM20抗体、緑色の微小管と一次抗αチューブリン抗体を示しています。特筆すべきは、単色Nup96イメージングで得られた優れた単一分子定位精度が、多ターゲット実験のすべてのターゲットで維持され、NPCで3.9 nm、α-チューブリンで4.0 nm、ミトコンドリアで3.3 nmの局在精度が得られたことです(図2B パネル1、2、3)。
大視野画像では、HeLaセル内の微小管をSDC-OPRシステムで利用可能なさまざまな倍率と、78nmから108nmの間のピクセルサイズを維持するための異なるカメラビニング設定を組み合わせてイメージングしました(図3)。図3Aは10個のHeLa細胞の微小管細胞骨格を示しており、色は局所化の精度を示しています。1×倍率では、平均定位精度は高倍率に比べて明らかに劣っており(図3B-D)、変動が顕著に観察されます。これは、広い視野でレーザーの出力密度が低下し、ガウス照明プロファイルが明らかになるため、視野の端に向かうにつれて精度が低下するためです。それでも、広大な211 × 211 μm² FOVにわたる平均定位精度9.5 nmの達成は、共焦点ベースのシステムとしては印象的であり、生物学的異質性の高解像度調査を可能にします。
最後に、固定されたHeLa細胞の共焦点体積~500 nm厚、zステップ1 μmのDNAPAINT画像を取得することで、システム内の最大倍率(4×、53 × 53 μm² FOV)で、全細胞のイメージングが可能であることが示されています。 図4A は各 z平面の単一分子再構成画像と、対応する局在精度およびNeNA値を示しています。さらに、 図4CにはHeLa細胞内の微小管ネットワークの3Dカラーレンダリング可視化が提供されています。深さが増すにつれて、散乱や光学収差により検出される光子の数が減少し、その結果、Cramér-Rao下限(CRLB)(図4A右)から導出される定位精度とNeNA計量で計算される位置特定精度の両方で低下します。それでも、SDC-OPRシステムによる高レベルの光子収集により、SMLM≤10 nm、最大9 μm深さ、狭い分布でのSMLM 可能σとなります。実際、二重壁のフィラメント微小管構造は、カバースリップ-セル界面付近、中間軸位置、細胞上部で明確に解像されており、ピーク間距離は30nmから40nmの間で(図4C)、報告された値24と一致しています。これらの結果は、SDC-OPRが広い視野角およびセル全体の高さにわたって高解像度イメージングを提供できることを強調しています。
<img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig1.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 1"> 
図1: 異なる細胞サンプルの平面内単一分子局在顕微鏡および多色超分解能イメージング。 (A) 光子回収を最大化するために設計されたマイクロレンズアレイを備えたスピニングディスク共焦点(SDC-OPR)システムの回路図。(B) DNA-PAINTの概略図:蛍光標識されたDNA鎖( イメージャー ズ鎖)は、対象タンパク質を標的とする抗体/ナノボディに固定された補完的なDNA配列(ドッキング 鎖)と一時的にハイブリダイズします。これらの短命な結合イベントは、確率的な点滅として見える蛍光信号を生成します。(C) SDC-OPRシステム上で、U2OSセルのNPCを4×倍率で代表的なDNA-PAINT画像取得。高解像度の能力は挿入図で示されており、個々のNPCが明確に解決されています。(D) SDC-OPR強化DNA-PAINTは、白い矢印で孔構造内の特徴的なNup96タンパク質ペアを強調する単一のNPCの可視化を可能にします。(E) 単一のNPC対称単位内のNup96ダイマー(n=16ペア)間の距離測定分布。この図はZazaら14から修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig2.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 2"> 
図2:SDC-OPR顕微鏡を用いた多色イメージングのためのExchange-PAINT。 (A) 3つのターゲットを順次画像したExchange-PAINTの回路図。3つのタンパク質標的はDNA官能化抗体、Fab断片、またはナノボディで標識されました。Cy3Bイメージャーのストランドは、画像化ラウンド間でウォッシュステップを経て、ストランドの種類ごとに順次イメージングされました。(B) SDC-OPR顕微鏡(4×倍率)を用いたU2OS細胞の三色交換-PAINT画像化。微小管(赤色;DNA結合抗αチューブリンで標識済み)、ミトコンドリア(緑色;TOM20標的DNAナノボディ)、およびNPC(青色;mEGFPタグ付きNup96と抗GFP DNAナノボディ)。スケールバー:5 μm。ズームイン領域はSDC-OPRシステムで得られた高解像度を強調し、(1)ミトコンドリア、(2)微小管、(3)NUPに焦点を当てています。スケールバー=1μm。この図はZazaら14から修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig3.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 3"> 
図3:SDC-OPR顕微鏡による大視野内でのDNA-PAINTイメージング。マイクロチューブDNA-PAINT画像(アンチαチューブリン標識)は、(A)1×倍率と1ビニング(FOV211 × 211 μm²)、(B)2.8×および2ビニング(FOV76 × 76 μm²)、(C)4×倍率・4ビニング(FOV 53 × 53 μm²)で取得。カラーは1倍倍の倍率の場合0-16 nm、その他の倍率では0-4 nmの定位精度を表します。(D) FOV中心から異なる距離(μm単位)で測定した位置定位精度。1×(赤)、2.8×(黄)、4×(緑)の倍率。この図はZazaら14から修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>
<img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69531/69531fig4.jpg" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Figure 4"> 
図4:全細胞DNA-PAINTイメージング。 (A) 左。 SDC-OPRを用いて4×倍率で取得した HeLa細胞の 体積微小管イメージングを行い、z=0から9μmまでの軸方向断面(1μmステップ)を表示しました。各平面は z 位置、定位精度、NeNA計量を示します。スケールバー:5μm(xy)。 そうだね。すべての飛行機における定位精度と貫通深度の比較。(B)(A)と同じHeLaセル上の微小管ネットワークの3Dレンダリング。色は0から9μmまでの貫通深度を表します。(C) (A)に示された各貫入深度から強調された小さな領域のズーム画像。この図はZazaら14から修正されています。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69531/69531fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版はこちらをクリックしてご覧ください。</a>

光学光子再割り当て を用いた回転円 板共焦点によるDNA-PAINTによる全セル超分解能イメージング

Single-molecule localization microscopy (SMLM) enables nanoscale imaging of cellular structures but is typically restricted to imaging near the coverslip ...

私たちのプロトコルでは、回転円盤共焦点顕微鏡上で光学光子再割り当てを用いたDNA-PAINTを用いて深度制限を克服します。DNA-PAINTは現在、多重化や定量的能力を備えた非常に高い解像度を実現しており、PALMやSTORMなど他のSMLM技術を上回っています。まず、光学光子再割り当てユニットとsCMOSカメラを備えた回転円盤共焦点システムを使用します。イメージングの30分前に顕微鏡、カメラ、レーザーを起動してシステムを起動します。それからコンピューターを起動します。NIS-Elementsソフトウェアが完全に読み込まれるのを待ちます。次に、NIS-Elementsで「SoRa Spinning Disk」を選択して適切なイメージングモードを選択し、取得パラメータを設定します。単一分子イベントの検出を最大化するために、60倍Apo数値開口1.49オイル浸漬対物レンズを選択してください。次に、対物レンズ、カメラ設定、サンプルに基づいて適切な倍率を選択します。カメラの曲げを調整して、選択した倍率に合わせて調整してください。DNA-PAINT取得のための露光時間を設定します。次に、レーザーの波長、レーザー出力、フィルターホイールをイメージャー染料スペクトルに合わせて設定します。対物レンズ後にレーザー出力を記録するには、比較済みのレーザーパワーメーターセンサーを試料面近くの顕微鏡ステージに設置し、測定された出力を記録します。次に、クリーンな60倍Apo数値絞り1.49のオイル対物レンズに浸漬油を一滴塗ります。準備済み免疫染色細胞サンプルをステージアダプターで顕微鏡ステージに固定し、ドリフトを最小限に抑えます。明視野モードに切り替え、ナノ粒子を基準にガラス面にフォーカスします。その後、パーフェクトフォーカスシステムを起動して習得中に集中力を維持します。パーフェクトフォーカスシステムを有効にした状態で、緑色蛍光タンパク質チャネルへの励起を一時的に変えて最適な焦点面を特定します。この段階では低出力のレーザーを使用してください。実験名と保存経路を定義してください。タイムボックスにチェックを入れて、間隔、時間、ループ数を設定します。間隔を遅延なしに設定し、フレーム数に対応するループ数を入力します。下部のPFSボックスが選択されているか確認してください。以前設定したSoRa励起設定に戻り、「今すぐ実行」を押してください。最初のタンパク質に対して300ミリ秒の積分時間で15,000から20,000フレームを取得します。画像解析のために、畳み込みを解いた画像スタックをピカソの局所化モジュールに読み込みます。メニューバーから「Analyze」を選択し、次に「Parameters」を選び、メーカー仕様に従ってカメラ固有のパラメータを入力します。次に、単一分子の局在精度を最適化するために箱の側面の長さを7に設定します。適切な最小正味勾配値を選択し、検出されたローカライゼーションを可視化するためにプレビューを有効にしてください。勾配閾値を調整してバックグラウンド検出を最小限に抑えましょう。次に「分析」を選択し、次に「ローカライズ」を選んで、すべてのフレームでスポットの特定とフィッティングを開始します。得られたhdf5をPicasso Renderモジュールに読み込み、再構築されたローカライゼーションマップを可視化します。ポストプロセスを選択し、その後RCCによるアンドリフトを選びます。1,000から始まる初期のセグメンテーション値を入力すると、xyドリフトプロットが得られます。ドリフト補正を改善するために、より低いセグメンテーション値で繰り返します。レンダーモジュールを閉じる前に、ファイルとローカリゼーションの保存をクリックして、ドリフト補正済みのローカライゼーションファイルを保存してください。次に、ドリフト補正ファイルをピカソフィルターモジュールに読み込み、局所精度、点拡散関数の幅、光子数、その他の品質指標に基づく閾値を適用します。フィルターモジュールを閉じる前に、ファイルとローカリゼーションの保存をクリックしてフィルタリング済みのローカライズファイルを保存してください。U2OS細胞内のヌクレオポリン96にモノマー強化緑色蛍光タンパク質を標識したDNA-PAINTイメージングにより、視野全体に明確で超分解型の核孔複合体パターンが生成されました。ズームインすると、核孔の予想される8対称性を持つ対対のヌクレオポリン96サブユニットが確認されました。整列したヌクレオポリン96ペア間のユークリッド距離の測定では、ピーク間13プラスマイナス2ナノメートルの間隔が示されました。ヌクレオポリン96、ミトコンドリア、微小管はU2OS細胞内で同時に可視化され、すべての標的に対して単一分子の位置定位精度が保持されました。大視野 HeLa細胞内の微小管の画像診断では、局在精度は倍率や視野の大きさによって変動し、低倍率では精度が低下することが示されました。高倍率は1倍倍率と比べて位置定位精度が向上し、より均一な精度をもたらしました。細胞全体のイメージングは、細胞深さ全体にわたる複数の軸面にわたる微小管ネットワークのDNA-PAINT取得によって実証されました。画像深さが増すにつれて、定位精度は徐々に低下しました。二重壁微小管構造は、ピーク間距離が30ナノメートルから40ナノメートルの複数の軸方向位置で解像されました。当社のプロトコルは、分解能を犠牲にすることなく、シンプルで市販の光学機器を用いて、深層細胞および組織のDNA-PAINTイメージングを実現します。高解像度DNA-PAINTは主にTIRFや高照明の下で動作し、画像深さは数ミクロンに制限されます。私たちの発見により、DNA-PAINTは多くの研究所で利用可能となり、細胞や組織の深部でのナノスケールイメージングが可能になります。

whole-cell-super-resolution-imaging-via-dna-paint-on-spinning-disk

Research

JoVE Journal

Biology

生物学

我々は、細菌のFtsZ-リングの構造、組織、細胞分裂に不可欠な装置を検査する、超解像イメージング法を説明します。この方法は、光活​​性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）画像の定量分析に基づいており、他の細菌の細胞骨格タンパク質に適用することができます。...

細菌分裂機械の超解像イメージング

我々は、光活性化ローカライゼーション顕微鏡（PALM）ベースの固定、培養神経細胞内の小胞の研究を実装する方法について説明します。我々のプロトコルの主要な構成要素は、photoconvertibleキメラで小胞を標識する超解像顕微鏡システムでまばらにサンプリングされた生の画像を収集し、超解像画像を生成するために生の画像を処理挙げられる。...

神経高密度コア小胞の超解像イメージング

生細胞内の動的タンパク質に関する時空間的な情報は、生物学を理解するために非常に重要です。高速3D構造化照明顕微鏡(f3D-SIM)と呼ばれる超解像顕微鏡の一種は、細菌の細胞動態Zリングに関するユニークな情報、つまりそのビーズ状の外観とリング内のFtsZの急速なダイナミクスの両方を明らかにします。...

高速3D-構造化照明顕微鏡（F3D-SIM）を使用したライブ細菌における細胞質分裂のZリングの超解像イメージング

このプロトコルでは、相関超解像光学顕微鏡および走査型電子顕微鏡像によるゼブラフィッシュの網膜の細胞内タンパク質局在結果を取得する必要な手順について説明します。...

ゼブラフィッシュの網膜におけるタンパク質局在を解決する相関超解像および電子顕微鏡観察

この資料では、プラズマまたは哺乳類細胞における地上州枯渇 (GSD) 超解像顕微鏡法を用いた細胞膜タンパク質の検出のためのプロトコルについて説明します。ここでは、我々...

哺乳類細胞における地上州枯渇超解像イメージング

このプロトコルは、生きた3次元イメージングのための細菌サンプルを調製し、マウントする方法と、それらの画像から大腸菌の三次元形状を再構築する方法を説明します。...

正確な細胞表現と正確なタンパク質局在化のための細菌細胞の三次元イメージング

ここで提示される、インタクト組織における超解像ライブ細胞イメージングのためのプロトコルである。我々は、そのネイティブ組織環境で非常に敏感な成体幹細胞集団をイメージングするための条件を標準化しました。この技術は、生きた組織における生物学的現象の直接観察を可能にするために、時間的および空間的分解能のバランスを取ることを含む。...

細胞下構造の超分解能ライブ細胞イメージング

基底膜は、発生中の組織および器官の形態形成に不可欠である。この構造の適切な配置につながるメカニズムをよりよく理解するために、提示されたプロトコルは、共焦点および超解像顕微鏡法を用いて上皮細胞における基底膜タンパク質の細胞内輸送および分泌を視覚化および特徴付ける方法を記載している。...

ショウジョウバエの卵子形成期における分極細胞内輸送と基底膜タンパク質の分泌の共焦点および超解像イメージング

超解像顕微鏡は、減数分裂におけるシナプトン複合体内の成分の構成に関する詳細な洞察を提供することができます。ここでは、 カエノラブディティス・エレガンス ・シナプトン複合体の個々のタンパク質を分解するためのプロトコルを示します。...

カエノラブディティス・エレガンス生殖系列内のシナプトン複合体の超解像顕微鏡

このプロトコルは、高解像度のセルラーおよびサブセルラー画像診断のための、多重アレイ検出器と統合されたレーザー走査共焦点顕微鏡システムの高度なイメージングアプリケーションおよび共有リソース管理について詳述しています。このワークフローにより、共焦点から超分解能(~120nm)までのマルチモーダルイメージングが単一のプラットフォーム内で可能となり、ナノスケールの可視化をより容易にします。...

超分解能イメージングと共有管理:多重検出を伴う共焦点顕微鏡のプロトコル

学ぶ光学光子再割り当てを用いた回転円板共焦点顕微鏡によるDNA-PAINTイメージング手法。特殊光学系不要で全細胞の単一分子局在顕微鏡を実現し、神経科学における高分解能細胞構造解析に応用可能です。

光学光子再割り当てを用いた回転円板共焦点によるDNA-PAINTによる全セル超分解能イメージング

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