Name: LC-MS/MSによる原一次ALL細胞におけるビンクリスチンの細胞内定量のための エクスビブ 顕微法の開発と標準化 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-01-23T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: 学ぶLC-MS/MS法によるビンクリスチン定量法を小児急性リンパ芽球性白血病細胞で確立する方法。薬物蓄積の評価により治療戦略の最適化と臨床応用への貢献が期待されます。

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<ol><li>Inaba, H., Pui, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+the+diagnosis+and+treatment+of+pediatric+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">Advances in the diagnosis and treatment of pediatric acute lymphoblastic leukemia.</a> J Clin Med. 10 (9), 1926(2021).</li>
<li>Pui, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+progress+through+collaboration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood acute lymphoblastic leukemia: progress through collaboration.</a> J Clin Oncol. 33 (27), 2938-2948 (2015).</li>
<li>Gaudichon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+extramedullary+relapse+in+acute+lymphoblastic+leukemia%3A+reconciling+biological+concepts+and+clinical+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Blood+Rev%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of extramedullary relapse in acute lymphoblastic leukemia: reconciling biological concepts and clinical issues.</a> Blood Rev. 36, 40-56 (2019).</li>
<li>Dhyani, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+potential+of+alkaloids%3A+a+key+emphasis+on+colchicine%2C+vinblastine%2C+vincristine%2C+vindesine%2C+vinorelbine+and+vincamine%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell+Int%22%5BJournal%5D)">Anticancer potential of alkaloids: a key emphasis on colchicine, vinblastine, vincristine, vindesine, vinorelbine and vincamine.</a> Cancer Cell Int. 22, 206(2022).</li>
<li>Mateus, A., Matsson, P., Artursson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+intracellular+unbound+drug+concentrations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of intracellular unbound drug concentrations.</a> Mol Pharmaceutics. 10 (6), 2467-2478 (2013).</li>
<li>Chien, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+method+to+determine+intracellular+drug+concentrations+in+cellular+uptake+assays%3A+application+to+metformin+in+organic+cation+transporter+1-transfected+human+embryonic+kidney+293+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab+Dispos%22%5BJournal%5D)">Rapid method to determine intracellular drug concentrations in cellular uptake assays: application to metformin in organic cation transporter 1-transfected human embryonic kidney 293 cells.</a> Drug Metab Dispos. 44 (3), 356-364 (2016).</li>
<li>Calcagno, A. M., Ambudkar, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+expression+of+drug+resistance-linked+ABC+transporters+in+cancer+cells+by+quantitative+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of expression of drug resistance-linked ABC transporters in cancer cells by quantitative RT-PCR.</a> Methods Mol Biol. 637, 121-132 (2010).</li>
<li>Richter, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+donor+to+the+lab%3A+a+fascinating+journey+of+primary+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">From donor to the lab: a fascinating journey of primary cell lines.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 648272(2021).</li>
<li>Borgmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Childhood+ALL+blasts+retain+phenotypic+and+genotypic+characteristics+upon+long-term+serial+passage+in+NOD%2FSCID+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Childhood ALL blasts retain phenotypic and genotypic characteristics upon long-term serial passage in NOD/SCID mice.</a> Pediatr Hematol Oncol. 17 (8), 635-650 (2000).</li>
<li>Rosati, M. M., Corrêa, J. R., de Sousa Mariano, S., Cardoso, A., Andrés Yunes, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+model+of+leukemia+relapse+to+induction+chemotherapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine model of leukemia relapse to induction chemotherapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> J Vis Exp. (224), e68797(2025).</li>
<li>Dams, R., Huestis, M. A., Lambert, W. E., Murphy, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrix+effect+in+bioanalysis+of+illicit+drugs+with+LC-MS%2FMS%3A+influence+of+ionization+type%2C+sample+preparation%2C+and+biofluid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Matrix effect in bioanalysis of illicit drugs with LC-MS/MS: influence of ionization type, sample preparation, and biofluid.</a> J Am Soc Mass Spectrom. 14 (11), 1290-1294 (2003).</li>
<li>Yang, Y., Cruickshank, C., Armstrong, M., Mahaffey, S., Reisdorph, R., Reisdorph, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+sample+preparation+approach+for+mass+spectrometry-based+profiling+of+plasma+results+in+improved+coverage+of+metabolome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">New sample preparation approach for mass spectrometry-based profiling of plasma results in improved coverage of metabolome.</a> J Chromatogr A. 1300, 217-226 (2013).</li>
<li>Zhang, J., Dasgupta, A., Ayala, R., Bonapace, C., Kassim, S., Faustino, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Internal+standard+variability%3A+root+cause+investigation%2C+parallelism+for+evaluating+trackability+and+practical+considerations%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">Internal standard variability: root cause investigation, parallelism for evaluating trackability and practical considerations.</a> Bioanalysis. 16 (15), 771-776 (2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2.0 mL ねじ蓋バイアル</td><td>フローサプライ</td><td>8-2400</td><td>同社製のガラスインサート(5×29 mm)と組み合わせて使用(カタログ5-29015)</td></tr><tr><td>2.0 mL ねじ蓋バイアル</td><td>フローサプライ</td><td>8-2400</td><td>同社製のガラスインサート(5×29 mm)と組み合わせて使用(カタログ5-29015)</td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>メルク(シグマ・オルドリッチ)</td><td>100030</td><td></td></tr><tr><td>アセトニトリル</td><td>メルク(シグマ・オルドリッチ)</td><td>24010152</td><td></td></tr><tr><td>目標V</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>12055091</td><td></td></tr><tr><td>クロマトグラフィーシステム Acquity UPLC Hクラス</td><td>ウォーターズ社</td><td>https://www.waters.com/nextgen/br/pt/products/chromatography/chromatography-systems/acquity-uplc-h-class-plus-system.html?srsltid=AfmBOoo0mjNgaucBI-Exv97cEmWE96_lVkqKi2IR0IPtA-h1feG-WvtW</td><td></td></tr><tr><td>伯爵夫人3 FL</td><td>サーモフィッシャー・サイエンティフィック</td><td>A49892</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>メルク(シグマ・オルドリッチ)</td><td>D 8418</td><td></td></tr><tr><td>ファルコン 50 mL</td><td>サーステット</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>蟻酸</td><td>メルク(シグマ・オルドリッチ)</td><td>F0507</td><td></td></tr><tr><td>ガラス瓶</td><td>メルク(シグマ・オルドリッチ)</td><td>41121800</td><td></td></tr><tr><td>インキュベーター</td><td>PHCBI</td><td>MCO-50M-PE</td><td></td></tr><tr><td>メタノール</td><td>メルク(シグマ・オルドリッチ)</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ 1.5 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>41121702</td><td></td></tr><tr><td>マイクロチューブ 2.0 mL</td><td>エッペンドルフ</td><td>30120094</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>メルク(シグマ・オルドリッチ)</td><td>PPB006</td><td></td></tr><tr><td>Speevac miVac</td><td>フィッシャー・サイエンティフィック</td><td>56340</td><td></td></tr><tr><td>データ取得用のソフトウェア</td><td>ウォーターズ社</td><td>マスリンクス</td><td></td></tr><tr><td>三重クアドルーポール質量分析計 Xevo TQ-S micro</td><td>ウォーターズ社</td><td>https://www.waters.com/nextgen/us/en/products/mass-spectrometry/mass-spectrometry-systems/xevo-tq-s-micro.html?srsltid=AfmBOoqqmLRNfHGqvtnwaL7xYOOEXPV3NJ9qYNH9HAwqXKXrMvLRQXSW</td><td></td></tr><tr><td>超音波超音波装置</td><td>クイミス</td><td>Q335D</td><td></td></tr><tr><td>ビンブラスチン 1 mg/mL</td><td>リブス</td><td>https://www.libbs.com.br/nossos-produtos/antineoplasico-faulblastina/</td><td>ビンブラスチン硫酸塩</td></tr><tr><td>ヴィンクリスチン</td><td>ケイマン・ケミカルズ</td><td>11764</td><td></td></tr></tbody></table>

lc-ms/msによる原一次all細胞におけるビンクリスチンの細胞内定量のための エクスビブ 顕微法の開発と標準化

Development and Standardization of an Ex Vivo Micromethod for Intracellular Quantification of Vincristine in Primary ALL Cells by LC-MS/MS

VCRおよびVINBを併用した一次ALL PDX細胞を用いた細胞内蓄積アッセイ後に得られた代表的なクロマトグラフィー結果は 図1に示されています。サンプルは各条件ごとに2.5個×10個の6セルを用いて調製されました。記載されたクロマトグラフィー条件下では、VCRは2.85分で一貫してマトリックス効果を最小限に抑え、ピーク形状は対称的かつ良好に分解能が取れました。これらのプロファイルは、プロトコルが正しく実行された場合にVCRとVINBの期待されるクロマトグラフィー挙動を示しています。
このプロトコルを原発性白血病細胞に適用する前に、方法の線形性、検出限界(LOD)、最適細胞数、およびインキュベーション時間を決定するための予備アッセイが実施されました。これらの手順は本プロトコルには詳細記載されていませんが、校正曲線の代表的な結果を方法検証の一部として以下に示しています。
この手法の感度と線形性を評価するため、VCRのキャリブレーション曲線は2つの実...

LC-MS/MSによる原一次ALL細胞におけるビンクリスチンの細胞内定量のための エクスビブ 顕微法の開発と標準化

Quantifying intracellular vincristine (VCR) in primary pediatric acute lymphoblastic leukemia (ALL) cells is essential for understanding sample-specific ...

私たちの目標は、臨床的に関連性の高いサンプル中の細胞内ビンクリスチンを測定し、薬物細胞間相互作用を調査することです。現在の実験課題は、モデル全体での培養時間を最適化することです。さらに、モデル依存型薬物の調整は、特に一次患者サンプルにおいて堅牢性を制限します。まず、15ミリリットルの蒸留水を入れたビーカーで37度の温度でバイアルを優しく回して、クライオ保存された細胞サンプルを解凍し、内容物が完全に解凍されるまで続けます。バイアルの内容物を、滅菌使い捨てパスツールピペットを使って、15ミリリットルの無菌1X PBSを含む50ミリリットルの円錐形チューブに移します。チューブを300Gに設定した遠心分離機に入れ、室温で5分間放置します。遠心分離後、チューブを滑らかに反転させて上清液を捨てます。次に、使い捨てパスツールピペットを使って細胞ペレットを10ミリリットルのAIM V培地に再懸濁させます。自動カウンターを使って生存可能な細胞を数え、平均細胞サイズを測定します。測定された細胞濃度に基づく単純な比率を用いて、2.5×10の生存細胞のべき乗を得るために必要な体積を計算します。使用前にビンクリスチンのストック溶液をボルテックスしてください。AIM V培地を2ミリリットルのマイクロチューブに加え、2.5×10の6セルの乗数を加え、必要な量のビンクリスチン溶液を加えます。短時間渦巻き、チューブを5秒間回してキャップから液体を集めます。次に、開いたマイクロチューブを37度の温度で5%二酸化炭素とともに3時間培養します。培養後、チューブの蓋を閉じ、300Gで室温で5分間遠心分離します。ピペットで上澄液を慎重に取り除きます。次に、室温のPBSを1ミリリットル加えます。遠心分離と洗浄の手順を繰り返した後、ピペットで残った上清液を慎重に除去します。ペレットを100マイクロリットルのPBSに再懸浮させ、完全に再懸浮するまでボルテックスを繰り返します。次に、0.1マイクロモルビンブラスチンを含む冷たいメタノール400マイクロリットルを、マイナス20度の温度で試料に直接加え、チューブ壁との接触を避けます。サンプルはマイナス80度の環境で一晩保管してください。遠心分離機を4度まで予冷してから、マイナス80度の冷凍庫からサンプルを取り出します。冷凍庫からサンプルを取り出した直後、13,000Gで4度Cで20分間遠心分離します。次に、ピペットを使って1.5ミリリットルのマイクロチューブに上清液300マイクロリットルを移します。サンプルを完全に乾燥させ、45度Cに設定された真空濃縮器に1時間40分置きます。乾燥後、ピペットを使って0.1%の蟻酸を含む400マイクロリットルの水に各ペレットを再懸浮させます。ペレットが完全に溶けるまで優しく渦巻きます。次に、13,000Gで4度の温度で20分間、サンプルを遠心分離します。300マイクロリットルの上清液を2ミリリットルのスクリュートップバイアルに移し、液体クロマトグラフィーと並列質量分析を行います。ソフトウェアのホーム画面でサンプルリストを開き、サンプル名、注入体積、バイアル位置、使用する方法を入力して新しいリストを作成します。超純水入りのバイアルをオートサンプラートレイに入れ、サンプルリストの空白として指定します。三重注射の間にはブランクを回して、持ち越しを防ぎましょう。サンプルリストから希望する行を選択し、実行をクリックして「OK」で確認してデータ取得を開始します。ラン終了後、結果からサンプルを選択し、上部メニューバーのクロマトグラムをクリックしてクロマトグラムを閲覧できます。最後にホーム画面でターゲットリンクをクリックします。さっき実行されたファイルを選択して「処理」をクリックします。ビンクリスチン法を選択し、OKをクリックして出力表を生成します。1つの微小臼歯ビンクリスチンで3時間培養した原発急性リンパ芽球患者由来の異種移植細胞のクロマトグラフィー解析では、2.85分に対称かつよく分像されたVCRピークが一貫して示され、適切な保持とマトリックス干渉が最小限であることが確認されました。AIM V培地で生成されたビンクリスチンの校正曲線は、0.001から10マイクロモルまでの濃度間で強い線形性を示しました。同様に、2×10の6のRS4の乗がある場合、11個の細胞が追加され、0.01から1マイクロモールまでの直線的な反応が観察されました。ビンクリスチン蓄積の時間経過分析により、RS4;11細胞はビンクリスチンとビンブラスチンの比率で2〜3時間の停滞を示し、4時間から5時間でわずかに増加しました。一方、一次PDX細胞は2時間でピークを迎え、その後減少し、バランスの取れた潜伏時間として3時間の選択を支持しました。正規化されたビンクリスチン蓄積は6つのPDX患者サンプルで変動し、ビンブラスチン比率による正規化されていないビンクリスチンと平均細胞容積との間に正の相関が観察されました。断片解析により、ビンクリスチンの基底ピークはマスターチャージ比413.38の前駆体イオンに対応し、40ボルトのコーンエネルギーと16ボルトの衝突エネルギーの下で定量イオンが392.47、確認イオンが383.38で生成されることが確認されました。本プロトコルは、主に白血病細胞において直接かつ高感度な細胞内薬物測定を可能にすることで、間接アプローチの制約を克服しています。私たちのアプローチは、細胞内ビンクリスチンの直接測定を可能にします。たとえ細胞投票率が低くてもです。今後、細胞内薬物蓄積の違いが体外耐性と関連しているかどうかを調査し、関連するメカニズムを探っていきます。

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マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いたLC3、p62、およびLAMP1共局在の測定によるオートファジーフラックスの評価

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インビボ 脾臓T細胞のフローサイトメトリーによる腫瘍由来細胞外小胞の免疫原性スクリーニング

細胞外小胞(EV)は細胞生物学と細胞間コミュニケーションに貢献します。細胞の取り込みEVを可視化・定量化するための実用的なアッセイが必要です。現在のプロトコルは、ナノ濾過ベースのマイクロ流体デバイスによるEV単離に続く共焦点顕微鏡 による 3次元蛍光イメージングを利用してEV取り込みアッセイを提案している。...

共焦点顕微鏡イメージング解析による細胞外小胞取り込みアッセイ

ここでは、希少な細胞タイプの代謝物を正確かつ確実に測定するためのプロトコルを紹介します。細胞選別用の改良シース液や関連するブランクサンプルの生成などの技術的改善により、サンプルあたりわずか5000細胞のインプットで代謝物の包括的な定量が可能になりました。...

希少初代細胞のターゲットメタボロミクス

このプロトコルは、酵素的消化およびサイズ排除クロマトグラフィーを用いて、マウスの骨格筋および骨髄から小さな細胞外小胞を分離し、構造的に複雑で収量の少ない組織から小胞富集部分を再現可能にして下流の分子解析を可能にします。...

サイズ排除クロマトグラフィーによるマウス骨格筋および骨髄からの小さな細胞外小胞の単離

このプロトコルは、 ショウジョウバエの眼/触角成虫（EAD）に蛍光マークされ、遺伝的に定義されたクローンの腫瘍を生成する方法を示します。なお、第3齢幼虫とどのように遺伝子発現の変化と腫瘍侵襲性を可視化し、定量化するためにそれらを処理するからEADと脳を分析する方法について説明します。...

ザ<em&gt;ショウジョウバエ</em&gt;成虫盤腫瘍モデル：遺伝的モザイクを用いた遺伝子発現と腫瘍侵襲性の可視化と定量化

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LC-MS/MSによる原一次ALL細胞におけるビンクリスチンの細胞内定量のためのエクスビブ顕微法の開発と標準化

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