マウスにおけるヒト多能性幹細胞由来膵臓内分泌細胞の筋肉内移植

私たちは幹細胞由来のアイレットを用いてヒトの内分泌膵臓の発達を研究し、糖尿病の遺伝的基盤を理解しようとしています。従来の腎臓カプセル移植は非常に侵襲的です。筋内移植プロトコルは、より簡便で再現性が高く、低侵襲の代替手段を提供します。

まず、逆錐体マイクロウェルを含む24ウェルのマイクロウェルプレートの底面に5%の反付着溶液を0.5ミリリットル加えます。プレートを1,300gで室温で10分間遠心分離します。次に顕微鏡でマイクロウェルの空気泡を調べます。

プレートを再遠心分離後、閉じ込められた空気を除去するために、接着防止液を吸引します。次に、各井戸に0.5ミリリットルのPBSで洗い、もう一度洗浄工程を繰り返します。次に、hPSCから発育した培養膵前駆細胞を、0.5ミリモラーEDTAのPBSを1ミリリットルで洗浄します。

PBSに0.5ミリモラーEDTAを吸引し、ウェルにトリプシンを塗ります。その後、37度で8〜12分間孵化します。トリプシンをDMEM/F12またはPBSの2巻で希釈し、ピペッティングで細胞を優しく再懸浮させます。

サスペンションを円錐形のチューブに移し、すぐに次の工程に進みます。懸濁液を200gで室温で3分間遠心分離します。上清液を慎重に吸引し、ペレットを予め温めたS4培地に優しく再懸浮させます。

次に、マイクロウェル皿からPBSを吸引します。マイクロウェルプレートの各ウェルに1.25ミリリットルの懸浮セルを優しく加えます。100gで室温で3分間遠心分離し、マイクロウェル内で細胞を均等に分布させます。

マイクロウェルプレートを慎重に加湿インキュベーターに移します。分化培地で培地変化を行うには、ウェル壁に沿って優しく吸引し、ミュルウェルの乱流や細胞クラスターの移動を防ぎます。適切な量のクラスターを1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離機管に移した後、注射器を針のチューブアセンブリに接続し、S7培地を充填します。

クラスターをマイクロ遠心分離機チューブから直接チューブ内に吸引してください。チューブを半分に折り、折りたたんだ部分を200マイクロリットルのピペットチップに挿入します。次に、先端のチューブの針アセンブリを15ミリリットルの円錐形チューブに挿入し、テープで端をチューブの縁に固定します。

チューブを100gで4度Cで2分間遠心分離し、クラスターを圧縮し、すぐに氷の上に置きます。麻酔下のNODシドガンママウスにクラスターを移植するには、右脚の膝下の内側部分を剃り、70%エタノールで消毒します。次に、ピペットの先端からチューブを外し、シリンジに接続します。

チューブを圧縮したクラスターの近くに切り、針の鈍い端に取り付けます。生理食塩水を最初の塊が針の先端に到達するまで押し続けます。次にマウスをうつ伏せにして右側に傾け、右脚を伸ばします。

針を右太ももの内側区画に4〜5ミリ深く、内転筋と手腕筋の間に挿入します。その後、針を約3ミリ引いたままクラスターを注射します。注射器を回転させ、針を引き抜き、ネズミが回復するのを待ちます。

移植後6週間の移植片回復と組織切片の後、免疫染色を行い、その後の画像診断が可能になります。第4段階の膵前駆細胞の単一細胞懸濁液をマイクロウェルプレートに収め、サイズ制御された三次元集合体を生成しました。24〜48時間以内に、コンパクトな球状星団が形成されました。

蛍光顕微鏡検査により、報告型hPSCライン中にPDX1およびインスリン発現細胞の存在が確認されました。6週間後、移植部位は筋肉内にアイレット状の塊を識別する形でマクロ鏡的に可視化されました。切除後、エクスプラントは立体顕微鏡で淡い球状タイ構造として識別されました。

移植動物においてCペプチド陽性細胞の強固な検出が観察されました。インスリン染色により、移植片内にヒトのベータ様細胞が存在することが確認されました。グルカゴンおよびソマトスタチン陽性細胞が検出され、アルファ細胞およびデルタ細胞の保持が示されました。

このプロトコルは、移植されたヒト移植片の生存率および成熟の生体内機能的アッセイおよび評価を促進します。最も重要な考慮事項は、高品質な幹細胞分化とクラスター形成中の穏やかな細胞取り扱いを確保し、生存率を最大化し良好な細胞生存を確保することです。これらのモデルは、単一遺伝子糖尿病やベータ細胞機能障害の遺伝的メカニズムの検証を促進します。