MLVベースの偽ウイルスを用いたSARS-CoV-2侵入阻害薬の潜在的な抗ウイルス薬同定の手順

私たちの研究は、偽ウイルスシステムを用いてSARS-CoV-2の侵入を阻害する阻害剤の特定に焦点を当てています。SARS-CoV-2の侵入研究には、通常BSL-3のような高いバイオセーフティ隔離実験室が必要です。このプロトコルにより、標準的なBSL-2検査室で疑似ウイルスに用いられる安全な抗ウイルススクリーニングが可能になります。

まず、6ウェルの組織培養プレートをバイオセーフティキャビネットに置き、1ウェルあたり7.5×10の5のHEK 293由来細胞を2ミリリットルの完全培地にシードします。プレートは37度で5%の二酸化炭素を含んで一晩培養します。翌日、細胞の合流率が約50〜60%に達していることを確認しましょう。

翌日、ポリエチレニミンまたはPEI溶液を、1ミリリットルPEIストック1ミリリットルあたり1ミリグラム5マイクロリットルを、1.5ミリリットルのマイクロ遠心分離チューブ内の還元血清培地50マイクロリットルに加えて準備します。別個の1.5ミリリットルマイクロ遠心分離管で、同じ培地50マイクロリットルに2.5マイクログラムのGFPプラスミド発現を加えてDNA溶液を準備します。各チューブを短時間に渦巻きで混ぜ、5秒間回転させて室温で培養します。

10分間の培養期間中、細胞単一層を破壊せずに6ウェルプレートの各ウェルから培地を慎重に取り出し、各ウェルに抗生物質を含まない完全なトランスフェクション培地を1ミリリットル加えます。培養後、PEI溶液を含むチューブにDNA溶液50マイクロリットルを加えます。ピペットで6回ピペットで素早く混ぜ、室温で正確に3分間培養します。

次に、対応する井戸にPEI DNA複合体を素早く滴下に加えます。次に、プレートの縁をパラフィルムで封じ、スイングローターとプレートバケットを使って室温で1000Gの遠心分離機で30分間休まずに封印します。遠心分離後、パラフィルムを優しく取り除き、37度の温度で5%二酸化炭素を含んで3時間培養します。

次に、各ウェルのトランスフェクション培地を、予備加熱済みの完全なDMEM培地2ミリリットルに優しく入れ替えます。トランスフェクトした細胞を37度Cで5%二酸化炭素で48時間インキュベートし、蛍光顕微鏡でGFP発現を評価してトランスフェクション効率を評価します。前述のようにHEK 293T由来細胞を2つの6ウェルプレートにシードしました。

1枚のプレートはSARS-CoV-2スパイク疑似ウイルス生成用に、もう1枚はVSVG擬似ウイルス用に指定してください。実験当日にトランスフェクションミックスとPEI DNA複合体を準備し、室温で10分間培養します。インキュベーション中は、細胞単分子層を破壊しないように6つのウェルプレートの各ウェルから培地を慎重に取り出してください。

抗生物質なしの予熱済み完全トランスフェクション培地を各ウェルにゆっくりと1ミリリットル加え、培地がウェルの壁に沿って流れるようにします。前述のように、準備されたトランスフェクション複合体を細胞に加えてトランスフェクトします。トランスフェクション後48時間の培養後、各ウェルの上清液を50ミリリットルの無菌円錐形遠心分離機管に回収し、290Gで4度Cで7分間遠心分離機に入れます。

細胞フリー上澄液を採取し、滅菌0.45マイクロメートルのポリビニリデンフッ化物トップボトルフィルターユニットでろ過します。ろ過された上清液を1ミリリットルのアリコートで準備し、マイナス80度のシードを2.5×4のHSI細胞の乗数で保存します。これはSARS-CoV-2に敏感性の高い細胞株であり、96ウェルの組織培養プレート上で、1ウェルあたり50マイクロリットの完全なDMEMを1ウェルに置きます。検査対象の各疾患(スパークレス疑似ウイルス感染および非感染対照群を含む)ごとに三重ウェルを準備し、ラベル付けします。

プレートは37度で5%の二酸化炭素を含んで一晩培養します。トランスダクション当日には、各擬似ウイルスバッチのアリコートを氷で解凍し、逆転で優しく混合します。スパイクレスコントロールのアリコートも含めて。指定されたウェルに必要な量の擬似ウイルス製剤を直接追加します。

完全なDMEMで各井戸の体積を150マイクロリットルに調整します。次に、パラフィルムでプレートを密封し、遠心分離機で2,500Gの温度で室温で45分間休憩なしで保存します。パラフィルムのシールを外し、37度の温度で5%二酸化炭素を含んで72時間培養します。

培養後、製造元の指示に従ってルシフェラーゼアッセイ試薬を準備します。ルシフェラーゼ基質と5Xルシフェラーゼアッセイ溶解バッファーを室温で10〜15分間解凍します。5倍ルシフェラーゼ解析バッファーを滅菌水で1倍に希釈します。

注意深く吸引して上澄液を捨てます。次に、各ウェルに1Xリシスバッファーを30マイクロリットル追加します。皿を皿シェイカーに置き、室温で毎分150回転の速度で10分間振る。

逆さ顕微鏡で細胞溶解が完全に溶解し、区別できないことを確認するために、完全な細胞溶解を検証します。次に溶解液を不透明な白色96ウェルプレートに移します。各ウェルに50マイクロリットルのルシフェラーゼ基質を加えます。

プレートを円を描くように優しく動かして軽く混ぜ、プレートをルミノメーターに入れて発光を測定します。先述の通り、2.5×10のHSIセルを50マイクロリットルの完全なDMEMで、96ウェルプレートに設置しました。37度で5%の二酸化炭素で一晩培養します。

翌日、試験対象の化合物を1〜3回連続希釈し、0.5%ジメチル硫酸を含む完全なDMEMにアルビドールを準備します。マルチチャンネルピペットを使い、各ウェルから優しく培地を吸引します。各ウェルに対応する希釈化合物を50マイクロリットルに加え、完全なDMEMを12の対照井に加えます。

37度で5%二酸化炭素で1時間培養します。化合物を除去せずに、同じ濃度の完全な培地で希釈した各媒体に、SARS-CoV-2スパイク疑似ウイルス50マイクロリットルを直接添加します。プレートをパーフィルムで密封してください。

2、500Gの遠心分離機で、室温で45分間休まずに置きます。パーフィルムを除去した後、37度の温度で5%二酸化炭素を含んで72時間培養します。最後に、前述のルシフェラーゼアッセイを用いて感染性を定量化します。

分岐PEIを持つHEK 293T由来細胞のトランスフェクションは高いトランスフェクション効率をもたらし、約70%のGFP陽性細胞が得られました。形体転接から48時間後。感受性HSI細胞にSARS-CoV-2スパイク疑似ウイルスまたはVSVG偽ウイルスの減少量が感染した場合、擬似ウイルスの入力量増加とともに発光が線量依存的に増加することが認められました。

スパイクレスの擬似ウイルスや未感染細胞は非常に低い発光レベルを示しました。アルビドール化合物は疑似ウイルスの侵入抑制能力を検証し、スパイク偽ウイルスによって生成されるルシフェラーゼ活性に対して明確な用量応答阻害を生じさせましたが、VSVG偽ウイルスでは抑制が低いことが観察されました。アッセイの結果、Zプライムファクターは0.54であり、スクリーニング目的での適性を示しました。

30マイクロモルから始まる濃度でのアルビドール処理は、0.5%ジメチルスルホキシド載体のみを用いた細胞と比較して細胞の生存能力に有意な影響を与えませんでした。このプロトコルにより、最適化された条件下で高抗体価の擬似ウイルスの生成が可能となりました。これにより、研究者は疑似ウイルスの侵入を測定し、SARS-CoV-2スパイクを介して感染を抑制する化合物を特定することができます。

高いトランスフェクション効率は、高抗体価の疑似ウイルスを生成し、下流アッセイで信頼できる感染シグナルを得るために不可欠です。このシステムは、SARS-CoV-2変異株に対する高スループット抗ウイルススクリーニングおよび新規阻害剤の価値低下を支援し、他のウイルスのエンベロープタンパク質を示す疑似ウイルスの生成に容易に適応可能です。