CUT&RUNを用いた神経内分泌小細胞肺がん細胞株におけるヒストン修飾および転写因子結合部位のゲノムワイドマッピング

したがって、私たちの研究の目的は、転写因子を定義する系統と、さまざまなタイプの小細胞肺がんにおけるクロマチンリモデリングタンパク質との相互作用を特定し、転写の風景を調節し、これらの相互作用ががんの発症や進行を含む疾患過程にどのように寄与するかを明らかにすることです。私たちはCUT&RUNのような実験を行うことでこれを目指しています。これは次世代のシーケンシング技術であり、これらの異なる修飾されたヒストンやDNA結合転写因子のゲノム位置を全体的にプロファイリングまたは特定できる技術です。最終的には、この非常に攻撃的な肺がんの患者に対する新たな治療法の開発において、エピジェネティックに調節される新たな経路を特定したいと考えています。

まず、37度のインキュベーターから培養した小細胞肺がんの神経内分泌細胞を取り出し、顕微鏡で検査して品質を確認します。次にセル懸濁液を50ミリリットルの円錐管に移し、1,200gの温度で室温で5分間遠心分離します。フード内の真空を利用して円錐形のチューブから培地を吸引し、得られた細胞ペレットを20ミリリットルのPBSですすぎます。

チューブを1,200gで再度遠心分離し、5分間からPBSを吸引します。ペレットサイズに基づいてアキュターゼを加え、37度で3〜5分間培養して細胞ペレットを消化します。次に、10%FBSを含むPBSを5ミリリットル加えて混合し、単細胞懸濁液を得るために消化を終えます。

先ほど示したように細胞を再度遠心分離した後、ペレットをPBS5ミリリットルに再懸濁します。自動セルカウンターを使って開始細胞数を数え、その生存可能性と完全性を確認してください。必要なセル数を計算し、ピペッティング誤差を考慮して20%の追加量を加えます。

計算された細胞数を1.5ミリリットルのチューブに移し、600gで室温で3分間遠心分離します。ウォッシュバッファーに細胞を5×10の5細胞のべき乗で再懸浮させ、合計6回の反応を行います。1回の反応で100マイクロリットルのバッファーを使用し、均一な懸濁液を確保するために優しく丁寧にピペットを使いましょう。

再度細胞を遠心分離し、上澄液を取り除き、洗浄を繰り返します。洗浄細胞100マイクロリットルを8本のセットの各チューブに分け、そのセットには活性化されたコンカナバリンAビーズ10マイクロリットルを含みます。ピペットで優しく混ぜます。

ビーズセルスラリーを室温で10分間キュベートして細胞がビーズに結合し、チューブをミニ遠心分離機で素早く回してビーズが沈殿しないままスラリーを回します。真空管を0.2ミリリットルの真空管磁石ラックに置きます。スラリーが透明になるまで待ち、ピペットで上澄液を除去します。

その後、磁石からチューブを外します。すぐに各反応に50マイクロリットルの氷冷抗体バッファーを加え、優しくピペットでビーズを再懸浮させます。8本のストリップチューブには適切にラベルを貼ってください。

各反応管にH3K4me3、H3K4me1、免疫グロブリンG抗体それぞれ0.5マイクログラム、異なる供給源のE2F7ポリクローナル抗体0.6マイクログラムを加えます。各反応チューブの内容物を十分に混ぜてピペットで軽く混ぜ、チューブキャップを高くして4度のナテーターで一晩培養します。ヌテーターから8本のストリップチューブを取り出し、各チューブの底に液体を集めるために素早く回します。

次に、スラリーが澄むまでチューブをマグネットスタンドに置きます。その後、慎重にピペットで上清液を取り除き、捨てます。チューブを磁石スタンドに置き、各チューブを200マイクロリットルのコールドセル透過バッファーで2回洗浄し、洗った後は多チャネルピペットで上清液を除去します。

次に、マグネットスタンドからチューブを取り外します。各反応にすぐに50マイクロリットルの冷細胞透過性バッファーを加え、ピペットで優しく細胞とビーズを再懸浮させます。次に各反応に2.5マイクロリットルのタンパク質AG-微小球核酵素を加え、優しくピペットでよく混ぜます。

室温で10分間の培養後、チューブを素早く回転させます。スラリーが透明になるまでマグネットスタンドに戻し、その後上清液を取り除きます。ビーズを冷たい細胞透過性バッファーで2回洗浄した後、50マイクロリットルの細胞透過性バッファーに優しく再懸浮させます。

チューブを氷に置いたまま、前のステップの8本のチューブストリップの各反応に100ミリモラル塩化カルシウムを1マイクロリットル加えます。ピペットで優しくピペットでビーズを完全に再懸浮させ、効率的な消化を促進します。チューブをヌーターで4度摂氏で2時間培養し、培養中はチューブキャップを高く保ちます。

新しい1.5ミリリットルのチューブで、33マイクロリットルのストップバッファーと1マイクロリットルの大腸菌スパイクを1マイクロリットルのDNAスパイクを1回の反応で合成し、ストップバッファーミックスを準備します。優しく渦巻きて溶液を混ぜます。2時間の培養終了時に、各反応チューブに準備済みの停止バッファー混合物33マイクロリットルを加え、十分に混合します。

反応管を37度の温度でサーモサイクラーで10分間培養します。軽く回した後、チューブを磁石ラックに置き、溶液が透明になるまで待つ。CUT&RUN放出DNAを含む約85マイクロリットルの上清液を、新鮮な1.5ミリリットルのチューブに慎重に移します。

回収されたDNAを精製し、その量を評価し、品質管理のために断片サイズの分布を行います。その後、CUT&RUNライブラリの準備、定量化、インデックスライブラリプーリング、ペアエンド次世代シーケンスを進めます。アケテスキュート相同体1高細胞株、DMS79およびH146および神経原性分化因子1高細胞株では、H82は懸浮中で非接着型集合体またはコンパクト球状で増殖し、H446は混合形態を示し、約80%が固有細胞、20%が懸濁細胞で形成されました。

CUT&RUN DNA断片解析により、エンハンサーヒストンマークH3K4me1が全細胞株で最も高いDNA量を示し、次いでH3K4me3、E2F7とIgGが最も低いことが示されました。抽出されたCUT&RUN DNAでは、H3K4me1およびH3K4me3の断片サイズ分布に、単核体および二核体、さらにゲノムDNAに明確なピークが見られました。対照的に、E2F7やIgG対照群では明確なピークは検出されませんでした。

DNA入力が少ないにもかかわらず、E2F7やIgGを含むすべてのCUT&RUNターゲットに対して次世代シーケンシングライブラリが成功裏に構築されました。DMS79野生型およびH146ヘテロ接合変異細胞のヒートマップ解析では、H3K4me3およびE2F7シグナルは転写開始部位付近で濃縮され、H3K4me1シグナルはより広範囲に分布していることが示されました。ランダムに選ばれたクロマチン領域でのゲノムブラウザ可視化では、H3K4me3、H3K4me1、E2F7で明確なピークが認められ、IgGでは濃縮が認められませんでした。

そのため、伝統的に科学者や研究者はクロマチン免疫沈殿法を用いて、その後のシーケンシングやChIP-seqを用いて、私たちが問うような疑問に取り組んできました。しかし、ChIP-seqはかなり多くの入力材料を必要とし、使用するモデルによっては必ずしも実現可能とは限りません。一方、CUT&RUNは入力材料が50,000セルと大幅に少なく、高スループットのシーケンス読み取りも少なくて済みます。そのためコストも低く、データ生成の背景処理も大幅に少なくて済みます。

CUT&RUNは、2D培養中の細胞だけでなく、患者由来のオルガノイドや異種移植など他の前臨床モデルにも応用可能な技術です。また、正常組織および病変組織を含む組織のクロマチン地形のプロファイリングにも利用されます。これはがん研究者にとって非常に有用な技術や手法ですが、さまざまな人間の病気を研究する非がん研究者にとっても非常に有用です。

このプロトコルにより、ヒストン修飾や細胞ゲノム内の多様なタンパク質の定着プロファイルのマッピングが可能になります。SCLCサブタイプ間でヒストンPTMとTF結合を提供することで、サブタイプ特異的な標的遺伝子や増強子やスーパー増強子などの調節要素が明らかになることがあります。