無性両生アブラナ科植物Rorippa aquaticaの効率的な再生ベースのアグロバクテリア媒介形質転換

無性植物向けの単純で拡張可能なアグロバクテリウム転換パイプラインが存在しない問題に対処し、遺伝子機能の分子解析を可能にします。最近では、全ゲノムおよび生理学的遺伝子発現研究で、ロリッパ・アクアティカが異質親愛性のモデルとして導入されました。これは土地から水への適応の分子基盤の研究に役立ちます。

まずは、葉が健康で縁が完全に見える2ヶ月の株を選びましょう。20×30センチの植物繁殖トレイを用意し、オートクレーブ用のペーパータオルを2層敷きます。ペーパータオルをきちんと折りたたみ、滅菌水で薄い水の層が表面に残るまで浸します。

実験台には100〜500ミリリットルの二重蒸留水、再懸濁接種量に適した滅菌容器、マイクロピペット、適切なピペットチップが設置されていることを確認してください。次に、選んだストック植物の花弁根元から10枚の葉をハサミで素早く切り取り、無菌水を入れたペトリ皿に入れます。2.5時間後、懸濁液1リットルあたり界面活性剤50マイクロリットルをピペットで抽出し、界面活性剤濃度を0.005%にします。

フラスコを優しく回して溶液を混ぜ、接種後に植え付け用のトレイが取り出せるようにしてください。次に、葉を上に向けて置きます。メスを使い、葉の中央肋に沿って垂直に1センチメートルの塊に切り、回転チューブミキサーで接種用のエクスプラントとして使える50ミリリットルのチューブに入れます。

アグロバクテリウム接種物をチューブ内に、すべての外出物質を完全に飽和させるのに十分な容量で注ぎます。チューブをロータリーミキサーに置き、室温で10分間攪拌して接種を行います。その後、鉗子を使って接種済みの葉の抜き苗をすべて溶液から取り出し、準備された繁殖トレイに直接置きます。

浸したエクスプラントを分けて均等に広げ、部分的に浸かるようにしてください。薄い水の層に浸かり、完全には浸かりません。次に、繁殖トレイをラップで密封します。トレイを暗い環境に置き、22度の常温で3日間培養します。

暗潜期間終了後は、トレイが透明なラップで密封されていることを確認します。必要に応じてトレイに二重蒸留水を加えて水分を保ちます。接種トレイを成長室に移し、栄養繁殖条件下で維持します。

再生したロゼットの苗を目視で検査し、移植適性を判断してください。複数の葉と根を持ち、長さが少なくとも2〜3ミリメートルの完全なシュート(入った柱)の存在を確認して理想的を識別します。その後、鉗子を使って無傷の遺伝子組み換えロゼット小株を切除します。

摘出された小苗は野生型クローン再生と同じ条件下で移植します。ロゼットの植物を摘出し、遺伝子組み換えの葉に接触しないように注意してください。遺伝子組み換えの葉のすぐ周囲の余分な葉を切り取り、1鉢に1株ずつ植え付けます。

移植した植物に肥料を与えた後は、十分に水やりをし、葉に霧をかけ、適切な条件で植えてください。最後に、芽や根がなかったり、移植には小さすぎる形質を含む移植植物を繁殖トレイに戻します。これらのエクスプラントは引き続きスクリーニングを行い、十分に成長したら移植してください。

生後1か月の1Tの苗の大半はキメラ状のルビー発現パターンを示し、少数は完全にルビー発現の葉を示しました。成熟した6か月齢の1T1の苗はキメラルビー発現を示しました。1T1の苗から切り取られたキメラルビー色素付き葉面は無性繁殖が可能でした。

切り取られたキメラの葉片は、切除後2〜4週間以内に完全なルビー発現またはキメラ状の小苗に再生し、再生中に根の形成が目に見えます。1か月後、私たちの2つのT-1の苗のほとんどは主にルビーの葉を展開しました。本プロトコルは無菌組織培養のステップを回避し、種子や花を持たない無性栄養繁殖植物に対して、形質転換再生パイプラインを提供します。

私たちの研究は、水中でのロリッパ・アクアティカにおけるエチレン経路活性化に関するもので、陸上植物の水中反応に関する重要な洞察を提供します。この手法は、光とホルモン経路がどのようにこの両生植物を水中で変態させるのかを調査する扉を開きます。