ローカライズされたRNAiと創薬リーチにおける外来遺伝子の発現が

薬用ヒルは、その単純さと入手しやすさに加え、初期胚から高齢期に至るまで、多くの異なる実験ツールを用いて個々のニューロンを静的に特定できるため、神経生物学的研究において有用なモデルシステムです。特に、胚期のヒルを用いた研究で期待されるのが、研究対象のニューロンまたはその標的における遺伝子発現を極めて精密に操作し、生きた個体内でニューロンの突起伸長をタイムラプスイメージングで観察することです。本ビデオでは、Alex Grossmanの研究室と当研究室の共同開発による空気圧キャピラリーガンを用い、生きたヒルの胚の内部層へ、迅速かつ正確に、そして高度に局在化した試薬注入を行うための新しい技術を紹介します。

この手法は、DNA、二本鎖RNA、および顕微鏡レベルの金粒子にロード可能なその他のあらゆる分子の送達に適用可能ですが、ここでは軸索誘導分子Rinのノックダウンおよびノックインの両方に使用します。こんにちは、カリフォルニア大学サンディエゴ校生物科学部のEduardo Ano研究室です。本日は、ショウジョウバエの全身体節の腹側体壁では自然に発現していますが、背側領域では発現していない軸索誘導分子Rinの発現をノックダウンまたはノックインさせる手順をご紹介します。

発生の初期段階において、二本鎖RNA分子またはプラスミドDNAを選択した体節の体壁および神経節に導入します。ニューマチックキャピラリーガンの使用による包括的な導入は、未処理の体節を内部対照として残したまま、亜体節の特定領域における遺伝子発現パターンの摂動を可能にするため、特に重要です。さらに、この手法を用いることで、標本を切り開くことなく、また組織を損傷させることなく、発生初期の細胞の内部層に到達させることができます。

最後に、ホリスティックデリバリーは、マイクロインジェクションによる単一細胞のノックダウンと、遺伝学的アプローチによる全身的なノックダウンの中間にあたる、選択した部位の限定的な細胞数を標的にできるという利点があります。それでは、始めていきましょう。medicinal LEは、中枢神経系が単純であり、約200対の両側性ニューロンと少数の巨大グリア細胞で構成されているため、神経細胞の特性や行動に関連する神経回路の研究に長年利用されてきました。

21個の体節にある各節後神経節、およびヒルにおける個々のニューロンは、初期胚から成熟個体に至るまで、個体間で繰り返し特定し研究することが可能です。ファラオの時代から、ヒルは瀉血の目的で使用されており、医学における継続的な利用により、市販の動物供給業者から容易に入手できます。しかし、私たちは神経系の発達を研究しているため、研究室で数百匹規模のヒルを飼育しており、これにより実験に必要な胚を安定的に確保しています。

ヒルは雌雄同体です。雌雄両方の生殖器官を持ち、交差受精を行います。そのため、すべての個体が卵を産むことができます。

彼らは「コクーン（繭）」と呼ばれる構造物の中に産卵します。このコクーンは、彼らが自身の体のC clay tellumとして知られる部位にある特殊な腺から、非常に興味深いポリマーを分泌させることで自作します。産卵の準備が整ったヒルは、水槽内に用意した苔の中に潜り込み、体の周囲にこの卵型のコクーンを形成し始めます。十分な材料が分泌され、分子の重合が始まると、ヒルはコクーン内部に卵と栄養となる卵黄を産み付け、自らは外へと脱出します。カミソリの刃を使用してコクーンの端に切り込み（ウィンドウ）を入れることで、胚を取り出すことができます。

一般的に、分化開始から約6日後になると、各繭の中に10〜20個の胚が含まれます。胚は繭から取り出し、池の水で飼育することが可能です。神経発達に関する実験的研究は、通常この段階から開始します。

本手順の最初の主要なステップは、コーティングされた粒子の調製です。本デモンストレーションでは、axon guidance molecule rinのlechホモログである二本鎖RNA分子でコーティングされた金粒子を、lech胚に導入する方法を示します。標的細胞は体壁の腹側縦走筋細胞であり、これらの細胞はAgenesisの早期段階からRinを発現し、放出することが知られています。

本研究の目的は、発生の可能な限り早い段階で単一の体節における自然発現をノックダウンし、この重要な発生因子に感受性を持つニューロンの分類にどのような影響が出るかを観察することです。この工程では、超音波洗浄機、ボルテックスミキサー、ベンチトップ遠心機、および氷バケツが必要です。また、使用前に氷上で冷却した100%isopropanolも必要となります。

50 mg/mLのvault粒子を含む結合バッファー100 µLを用意します。これらの粒子はRNAi用に設計され、chell社によって製造されたものです。次に、結合バッファー100 µLを加えて粒子溶液を希釈し、短時間ボルテックスした後、1〜2分間ソニケーションを行い、凝集している可能性のある粒子を分離させます。

2分間のシンジケーション後、5〜10 µgの二本鎖RNAを粒子に添加してボルテックスし、室温で2分間静置します。2分経過後、マイクロ遠心機を用いて、二本鎖RNA粒子複合体を2,500 RPM以上の低速で約15秒間遠心分離します。

ペレットを得るために、上清を除去し、ペレットをできるだけ乱さないようにして750 µLのイソプロパノールを加えます。マイクロ遠心機で短時間遠心分離し、遠心後の上清を除去します。その後、超音波処理により金粒子を100%の冷製イソプロパノールに懸濁させます。粒子を分散させるため、超音波洗浄機で2〜3回短くパルス処理を行います。

ガラススライドの上に注ぎ、溶媒を完全に蒸発させます。粒子を組織に導入する直前にコーティングすることで最良の結果が得られます。その手順について、次のステップで説明します。in situ トランスフェクションを行う前に、実験セットアップとその準備方法を確認しましょう。

粒子を胚の中へ正確に導入するため、ニューマチックキャピラリーガンをマイクロマニピュレーターに取り付けます。胚の表面をビデオ顕微鏡で観察します。半導体レーザーによって生成された光ビームをガンの内部キャピラリーに通し、標的組織への照準に使用します。

ガンのヘッドにある3つの入口に接続されたTitanチューブの独立したラインにより、単一のソースから加圧ヘリウムガスが供給されます。1本のラインは常に開放されており、ガン内にヘリウムガスを連続的に流します。他の2本のラインは通常、ソレノイドバルブで閉じており、チューブ内に充填された2種類の異なるコーティングを施した金粒子を含んでいます。

乾燥粉末として使用します。ガンの外側キャピラリーを、ゲージ圧-12.5 PSIの真空システムに接続します。目的の粒子浸透深さに調整するため、hiのヘッド圧を10から15 PSIの間で変化させます。

ヘリウムのヘッド圧力は粒子の浸透深さに大きく影響し、胚からガンまでの距離も同様に影響します。遺伝子ガンによって異なるノズルの直径は、ターゲット領域に合わせて適切に選択することが重要です。それでは、実験セットアップを説明しましたので、Jingガンに充填し、ゼブラフィッシュの胚にショットを行います。

Titanチューブに充填する前に、コーティングされた金粒子が完全に乾燥していることが極めて重要です。まず、カバーガラスまたはカミソリを用いて、ガラススライドからコーティングされた金粒子を掻き出し、折り畳んだホエイペーパーに充填できる状態にします。チューブはコネクタに近い部分でU字型に曲げておきます。これにより、粒子を充填する際にチューブ全体に広がることなく、コネクタ付近に集中させることができます。

小さなスパチュラまたはV字型に折った薬包紙で粒子をすくい取り、チューブに充填します。充填中は、指でチューブを軽く弾いて粒子を均等に分散させてください。チューブへの充填が完了したら、Jing gunを用いて二本鎖RNAを導入しますが、その前にヒルを準備します。

ここでは、約10日経過したヒル胚を確認できます。胚は現在、二本鎖RNAの導入前後に使用する滅菌培地の中にあります。実験用胚を二本鎖RNA導入に向けて準備する最初のステップは、V字型の溝がある平らな柔軟性シリコン上に、滅菌培地で調製した8% ethanol溶液を加えることです。

1個の胚を加え、粒子注入の直前に腹側を上にして配置します。チャンバー内の培地は胚の上端のわずかに下まで減らし、中央に小さな穴を開けたティッシュペーパーをその上に置いて、胚を固定し、表面の乾燥を防ぎます。同時に、本日使用する胚のステージにおいて標的とする領域のみを露出させます。ステージE 10では、縦走筋細胞は外表面から約10〜20 µm深さの、表皮、真皮、および環状筋の内側に位置しています。

胚発生段階（本研究ではE7からE12を使用）の胚において、腹側の中心神経節は体表から約50 µmの深さに位置しており、これは筋細胞とは異なります。神経節よりも浅い位置にある縦走筋を標的にするため、ヘリウム圧を調整します。これで、金粒子を用いて縦走筋にショットを打つ準備が整いました。

約0.5 mgの金粒子の充填量で、通常最大10回のショットに使用でき、1回のショットで通常数百個程度の粒子が導入されます。ショットは、バルブの1つを0.3秒間短時間開放することで生成され、これにより対応するチューブラインから粒子塊がガンボア内に注入されます。目的の組織領域をカバーするためには、多くの場合、複数回のショットが必要となります。

粒子を脱落させ、ガンのボア内の連続ヘリウム流への注入を容易にするために、ショットの間にチューブを軽く叩きます。同一のアッセイで2番目の試薬を導入したい場合は、金粒子の導入直後に、別の粒子を2番目のチューブにロードすることができます。胚を人工池水に戻し（できれば1皿につき1個の胚）、RNAiまたは異所性発現が十分であると判断されるまで1〜3日間保持します。

この間、胚は室温の暗室で保持されます。ここでは、narinのMr.NAノックダウンに関するin situハイブリダイゼーションアッセイについて説明します。処理された胚では、terrinを発現していない筋細胞がわずかに見られることがわかります。

これらの筋肉には粒子が含まれています。粒子をterrin二本鎖RNAでコーティングすると、narinの発現が明らかにノックダウンされることがわかります。これは通常、細胞あたり1〜2個の粒子が含まれる細胞においてのみ起こりました。GFPをコードするプラスミドで粒子をコーティングし、使用している空気圧キャピラリーガンで核内に導入すると、神経細胞において蛍光が認められます。

本デモンストレーションにおいて、私たちは標的領域の細胞に検出可能な損傷を与えることなく、生存胚の小さな局所領域にある細胞に両方の粒子を導入することができました。また、ノマディック・キャピラリーガンを用いることで、包括的な導入技術を実現し、3次元的に限定された組織の微小領域において、組織への検出可能な損傷なしに高精度に標的を絞り、遺伝子のノックインおよびノックダウンを行うという新たな能力を提示しました。以上となります。

ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。