Name: ローカライズされたRNAiと創薬リーチにおける外来遺伝子の発現が (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-04-17T22:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 19 s
Description: 学ぶ ヒル胚への局所的なRNAi導入法。気動式キャピラリーガンを用いてNetrin発現をノックダウンし、軸索誘導分子の機能を神経発生研究で解明する革新的なバイオリスティック技術です。

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我々は、ノックインと成長している感覚突起のタイムラプスムービーを提供するための遺伝子のために構造を生成する際に彼の助けのために博士はマイケルベイカーに感謝したいと思います。我々はまた、空気銃の実験と技術支援のためにバージニアVandelinderに感謝します。

粒子は、dsRNA分子、DNAプラスミドや染料などの異なる試薬で被覆することができます。粒子の種類と直径が試薬と組織における標的細胞の深さに応じて選択される：より大きな粒子がさらに浸透するが、組織に何らかの損傷を与える可能性があります。 1。 dsRNAを被覆粒子の​​調製<ol><li>氷の上で100％イソプロパノールを置きます。 </li><li> 100ミリリットル結合バッファーで、再懸5 mgの金粒子（平均粒径は1.6μmS1600ri、シーシェル技術、LLC）。解決策の準備ができたら、次の手順に進みます。 </li><li>結合バッファーを100μlを添加して粒子溶液を希釈し、ボルテックスで軽く混和し、凝集を避けるために1-2分間超音波処理。 </li><li> dsRNAを/ siRNAの5 -10μgの（dsRNAは/ siRNAは〜1μg/μlの濃度に水に溶解する必要がある）を追加します。 </li><li> 2分間、室温でボルテックスし、休暇。 siRNAの飽和金粒子のこれらの濃度と時間間隔の結果。 </li><li>ペレット〜15秒のためのベンチトップ遠心機で〜2,500 rpmで遠心分離によるsiRNA導入/金微粒子複合体。 </li><li>上清を除去し、穏やかにペレットの最小限の中断で750 mlの冷イソプロパノールを加える。簡単にスピンし、上清を取り除く。 </li><li> 100μlの冷100％イソプロパノールで金粒子を再懸濁し、次に粒子の凝集体を分割する（2-3パルス）バスの超音波処理で簡単に超音波処理。最後に、スライドガラスの上に懸濁粒子を注ぎ、室温で乾燥させます。 </li></ol> 2。特定のアッセイのための実験セットアップの準備<ol><li>それぞれの銃は最高〜3mmまで〜50μmの最小値に至るまで、さまざまなノズルの開口径を持っています。銃のために使用される特定したがって、対象となる組織の面積に応じて選択されます。 </li><li>彼の圧力は、一般的にアップ〜100μmの（より高い圧力はより深い粒子を提供することができます）に、標的細胞の組織の深さに調整されます。胚とノズルの先端間の距離はまた、空気中の金粒子緩い勢いとして、浸透の深さに影響を与えます。 </li></ol> 3。プレコート粒子でガンをロードする粒子は、マニホールドに接続されているタイゴンチューブの粒子注入ラインに乾燥粉末としてロードする必要があります。 4℃で使用していない時は、乾燥雰囲気で保管してくださいこのチューブは、、同じ試薬と追加の実験で再利用することができます。私たちの実験のセットアップは、マニホールド内の別のポートを介してアッセイ当たり二つの異なる試薬を供給することができます。 <ol><li>タイゴンチューブのラインにそれらをロードする前にガラスのカバースリップまたはカミソリの刃のエッジを使用してスライドガラスから乾燥被覆粒子をこすり落とす。このタイゴンチューブは、クロスコンタミネーションを避けるためにのみこの試薬に固有になります。 </li><li>パーティクルをロードするように、全体チューブと集中に近いコネクタに沿って広がってからの粒子を保つために、コネクタの近くにU字状にチューブを曲げて。小さなヘラまたは折り畳んだ重量紙、及び胚の各シリーズのチューブに、それらの約半分の負荷を持つ粒子を拾う。均等に粒子を分散させるロードステップ中にチューブをタップします。 </li></ol> 4。動物の準備金粒子の配信の前後に、胚を室温で無菌人工池の水に保持されます。 <ol><li>シリコーンゴム（Sylgard 184、ダウコーニング、ミッドランド、MI）のフラット、5mmの厚切りに刻まれた溝に、上胚、腹側を置き、（無菌人工池の水の8％エタノール溶液中でそれらをanaesthetizeの段階で若い胚E6 - E8）は、実験を通してのないエタノールで人工池の水に残すことができます。 </li><li>すぐに粒子を撮影する前に、ソリューションの一部を除去することによって胚の腹側表面を明らかにする浴室のレベルを下げます。それを安定化させ、乾燥からその表面を保つために、その上に中央にカット小さな穴を持つ組織の一枚の紙を置きます。 </li></ol> 5。標的組織への被覆粒子の​​配信粒子の一つの負荷は通常、シングルショットでは通常、数百の粒子のために提供するとともに、最大10枚まで使用することができます。 <ol><li>銃に対応するチューブラインからの粒子のボーラス注入を引き起こして、0.3秒のための弁の1つを開くことにより、ショットを生成する。 </li><li>チューブ壁からの粒子を取り除くため、ガンの彼ストリームに彼らの注入を容易にするために、ショットの間静かにチューブをタップします。 </li><li>興味の組織の領域をカバーするために、複数のショットが必要になることがあります。 </li><li>粒子の配信後、マルチウェルプレートに1ウェルあたり好ましくは一つの胚、バック人工池の水の中に胚を置く。 </li></ol> 6。免疫染色および神経ラベリング RNAiのが（または異所性発現）が達成されるまで、粒子の配信後1​​〜3日間室温でと暗闇の中で胚を保つ。我々は、実験試料とコントロールに関する次のいずれかの手順を実行します。 <ol><li>ネトリンのmRNAの有無についてのアッセイにin situハイブリダイゼーション 。ジゴキシゲニン標識リーチネトリンのリボプローブは、全体のリーチの胚にハイブリダイズさせる。 </li><li>ネトリン蛋白質と神経組織（例えば、抗アセチル化チューブリンなど）に固有の他のタンパク質のアッセイに免疫細胞化学 。手続きは、全マウント胚でも実行されます。 </li><li>治療と制御セグメントへの関心のニューロン（私たちのケースでmechanosensory圧力ニューロン）の完全な喬木にラベルを付けるために色素が、いっぱいになるための単一の神経細胞への脂溶性色素 （DIIとDIO）、 のMicroinjections。このアッセイは、ライブ胚（無傷または切開）で実行されます。 </li></ol>

<ol><li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+of+the+receptor+tyrosine+phosphatase+HmLAR2+in+a+single+cell+of+an+intact+leech+embryo+leads+to+growth-cone+collapse%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAi of the receptor tyrosine phosphatase HmLAR2 in a single cell of an intact leech embryo leads to growth-cone collapse.</a> Current Biology. 10, 1071-1074 (2000).</li>
<li>Baker, M. W., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Hirudo+medicinalis+DNA+Promoters+for+Targeted+Gene+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Characterization of Hirudo medicinalis DNA Promoters for Targeted Gene Expression.</a> Journal of Neuroscience Methods. 156, 145-153 (2006).</li>
<li>Gan, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+expression+of+a+leech+netrin+suggests+roles+in+the+formation+of+longitudinal+nerve+tracts+and+in+regional+innervation+of+peripheral+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Cellular expression of a leech netrin suggests roles in the formation of longitudinal nerve tracts and in regional innervation of peripheral targets.</a> Journal of Neurobiology. 40, 103-115 (1999).</li>
<li>Juven-Gershon, T., Cheng, S., Kadonaga, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+design+of+a+super+core+promoter+that+enhances+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rational design of a super core promoter that enhances gene expression.</a> Nature Methods. 3, 917-922 (2006).</li>
<li>Rinberg, D., Simonnet, C., Groisman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pneumatic+capillary+gun+for+ballistic+delivery+of+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Physics+Letters%22%5BJournal%5D)">Pneumatic capillary gun for ballistic delivery of microparticles.</a> Applied Physics Letters. 87, 014103(2005).</li>
<li>Shefi, O., Simonnet, C., Baker, M. W., Glass, J. R., Macagno, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtargeted+gene+silencing+and+ectopic+expression+in+live+embryos+using+biolistic+delivery+with+a+pneumatic+capillary+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Microtargeted gene silencing and ectopic expression in live embryos using biolistic delivery with a pneumatic capillary gun.</a> Journal of Neuroscience. 26, 6119-6123 (2006).</li>
</ol>

このデモでは、ノックインにライブリーチ胚の小さなローカライズされた体積のセルに金粒子を提供し、遺伝子をノックダウンする空気圧キャピラリー銃を使用。対象地域は、一般的に約150μmおよび粒子の直径は、0から50μmの間で調整可能だったの平均浸透深さ約〜15μmを、発見されたていた。粒子は軸索ガイダンス因子ネトリンのdsRNA分子でコーティングされたとき、彼らは明らかにだけ粒子を含む細胞で発生したネトリン発現のノックダウン見える原因。粒子は、彼らが核で停止した神経細胞におけるコードするプラスミドのGFP誘起蛍光でコーティング。 空気圧キャピラリー銃が組織に検出可能な損傷を与えることなく、三次元的に閉じ込められ、高精度で標的組織の顕微鏡の領域をターゲットに、微粒子銃配信の技術に新しい機能が提供されてどのように我々はあなたを示している。

<table><tbody><tr><td>金粒子</td><td>その他</td><td>Seashell Technology, LLC</td><td>S1600ri</td><td></td></tr><tr><td>結合バッファー</td><td>試薬</td><td>Seashell Technology, LLC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>シリコーンゴム</td><td>試薬</td><td>Dow Corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr></tbody></table>

ローカライズされたrnaiと創薬リーチにおける外来遺伝子の発現が

Localized RNAi and Ectopic Gene Expression in the Medicinal Leech

このビデオでは、我々は生きている組織への試薬の正確な微粒子銃配信のための空気圧キャピラリー銃の使用を示しています。我々は内部コントロールとして未処理のセグメントを残して、ヒル胚の選択されたセグメントに摂動の遺伝子発現パターンにプロシージャを使用します。 空気圧キャピラリー銃は、試料を開くことなく、開発の初期段階での細胞の内部の層に到達するために使用することができます。生体組織への物質のローカライズを導入する方法として、銃による遺伝子銃送達は、いくつかの利点があります：それは、高速、非接触および非破壊です。さらに、シングルキャピラリー銃は、異なる物質の独立した配信のために使用することができます。配達地域は、〜50から150ミクロンの横方向の寸法を持っていると、0〜50μmの間で調節可能である平均浸透深さ、周囲に15〜上程度を拡張できます。この配信は単一の細胞外注射を介して、または遺伝学的アプローチによるマイクロインジェクションし、全身のノックダウンによるノックダウンの間に中間の選択した場所にあるセルの限られた数を対象とすることができるという利点があります。 背側ドメインではないノックダウンまたは自然にある中央のニューロンによって、腹側体壁に表現されている軸索ガイダンス分子ネトリン、の式でノッキングの場合は、しかし、我々は、体壁にdsRNA又はプラスミド- DNAの分子を提供し、中枢神経節。 、（i）の特定のアッセイのための実験装置（加速圧力を調整する）の準備、（ⅱ）塗装ガンに被覆された粒子をロードするdsRNA又はDNAの分子と粒子、（III）：この手順は、次の手順が含まれます最大1アッセイ、（IV）の2つの試薬に（粒子の配信、（v）を標的組織（体壁または神経節）に被覆粒子の​​配信のために動物を準備し、そして（vi）の胚を処理して免疫染色、免疫組織化学と神経ラベリング）は2〜3日配達後、通常、結果を可視化する。 粒子がネトリンdsRNAをでコーティングされたとき、彼らは明らかに粒子のみを（通常は、細胞あたり1-2粒）を含む細胞内で発生したネトリン発現のノックダウン見える原因。粒子は、彼らが核で停止した神経細胞におけるプラスミドのエンコーディングEGFP誘起蛍光でコーティング。

このビデオでは、我々は新たな小型遺伝子銃を持つ生きている組織への試薬の正確な微粒子銃配信のための手順を示しています。我々は、単一セグメントの腹側体壁と神経節にdsRNAの分子を提供することで、ヒル胚における軸索ガイダンス分子ネトリンの発現をノックダウンされています。

ローカライズされたRNAiと創薬リーチにおける外来遺伝子の発現が

このビデオでは、生体組織へ試薬を正確にバイオリスティック輸送するために、空気圧式キャピラリーグンを使用する方法を紹介します。この手順を用いて、私たちは…

薬用ヒルは、その単純さと入手しやすさに加え、初期胚から高齢期に至るまで、多くの異なる実験ツールを用いて個々のニューロンを静的に特定できるため、神経生物学的研究において有用なモデルシステムです。特に、胚期のヒルを用いた研究で期待されるのが、研究対象のニューロンまたはその標的における遺伝子発現を極めて精密に操作し、生きた個体内でニューロンの突起伸長をタイムラプスイメージングで観察することです。本ビデオでは、Alex Grossmanの研究室と当研究室の共同開発による空気圧キャピラリーガンを用い、生きたヒルの胚の内部層へ、迅速かつ正確に、そして高度に局在化した試薬注入を行うための新しい技術を紹介します。この手法は、DNA、二本鎖RNA、および顕微鏡レベルの金粒子にロード可能なその他のあらゆる分子の送達に適用可能ですが、ここでは軸索誘導分子Rinのノックダウンおよびノックインの両方に使用します。こんにちは、カリフォルニア大学サンディエゴ校生物科学部のEduardo Ano研究室です。本日は、ショウジョウバエの全身体節の腹側体壁では自然に発現していますが、背側領域では発現していない軸索誘導分子Rinの発現をノックダウンまたはノックインさせる手順をご紹介します。発生の初期段階において、二本鎖RNA分子またはプラスミドDNAを選択した体節の体壁および神経節に導入します。ニューマチックキャピラリーガンの使用による包括的な導入は、未処理の体節を内部対照として残したまま、亜体節の特定領域における遺伝子発現パターンの摂動を可能にするため、特に重要です。さらに、この手法を用いることで、標本を切り開くことなく、また組織を損傷させることなく、発生初期の細胞の内部層に到達させることができます。最後に、ホリスティックデリバリーは、マイクロインジェクションによる単一細胞のノックダウンと、遺伝学的アプローチによる全身的なノックダウンの中間にあたる、選択した部位の限定的な細胞数を標的にできるという利点があります。それでは、始めていきましょう。medicinal LEは、中枢神経系が単純であり、約200対の両側性ニューロンと少数の巨大グリア細胞で構成されているため、神経細胞の特性や行動に関連する神経回路の研究に長年利用されてきました。21個の体節にある各節後神経節、およびヒルにおける個々のニューロンは、初期胚から成熟個体に至るまで、個体間で繰り返し特定し研究することが可能です。ファラオの時代から、ヒルは瀉血の目的で使用されており、医学における継続的な利用により、市販の動物供給業者から容易に入手できます。しかし、私たちは神経系の発達を研究しているため、研究室で数百匹規模のヒルを飼育しており、これにより実験に必要な胚を安定的に確保しています。ヒルは雌雄同体です。雌雄両方の生殖器官を持ち、交差受精を行います。そのため、すべての個体が卵を産むことができます。彼らは「コクーン（繭）」と呼ばれる構造物の中に産卵します。このコクーンは、彼らが自身の体のC clay tellumとして知られる部位にある特殊な腺から、非常に興味深いポリマーを分泌させることで自作します。産卵の準備が整ったヒルは、水槽内に用意した苔の中に潜り込み、体の周囲にこの卵型のコクーンを形成し始めます。十分な材料が分泌され、分子の重合が始まると、ヒルはコクーン内部に卵と栄養となる卵黄を産み付け、自らは外へと脱出します。カミソリの刃を使用してコクーンの端に切り込み（ウィンドウ）を入れることで、胚を取り出すことができます。一般的に、分化開始から約6日後になると、各繭の中に10〜20個の胚が含まれます。胚は繭から取り出し、池の水で飼育することが可能です。神経発達に関する実験的研究は、通常この段階から開始します。本手順の最初の主要なステップは、コーティングされた粒子の調製です。本デモンストレーションでは、axon guidance molecule rinのlechホモログである二本鎖RNA分子でコーティングされた金粒子を、lech胚に導入する方法を示します。標的細胞は体壁の腹側縦走筋細胞であり、これらの細胞はAgenesisの早期段階からRinを発現し、放出することが知られています。本研究の目的は、発生の可能な限り早い段階で単一の体節における自然発現をノックダウンし、この重要な発生因子に感受性を持つニューロンの分類にどのような影響が出るかを観察することです。この工程では、超音波洗浄機、ボルテックスミキサー、ベンチトップ遠心機、および氷バケツが必要です。また、使用前に氷上で冷却した100%isopropanolも必要となります。50 mg/mLのvault粒子を含む結合バッファー100 µLを用意します。これらの粒子はRNAi用に設計され、chell社によって製造されたものです。次に、結合バッファー100 µLを加えて粒子溶液を希釈し、短時間ボルテックスした後、1〜2分間ソニケーションを行い、凝集している可能性のある粒子を分離させます。2分間のシンジケーション後、5〜10 µgの二本鎖RNAを粒子に添加してボルテックスし、室温で2分間静置します。2分経過後、マイクロ遠心機を用いて、二本鎖RNA粒子複合体を2,500 RPM以上の低速で約15秒間遠心分離します。ペレットを得るために、上清を除去し、ペレットをできるだけ乱さないようにして750 µLのイソプロパノールを加えます。マイクロ遠心機で短時間遠心分離し、遠心後の上清を除去します。その後、超音波処理により金粒子を100%の冷製イソプロパノールに懸濁させます。粒子を分散させるため、超音波洗浄機で2〜3回短くパルス処理を行います。ガラススライドの上に注ぎ、溶媒を完全に蒸発させます。粒子を組織に導入する直前にコーティングすることで最良の結果が得られます。その手順について、次のステップで説明します。in situ トランスフェクションを行う前に、実験セットアップとその準備方法を確認しましょう。粒子を胚の中へ正確に導入するため、ニューマチックキャピラリーガンをマイクロマニピュレーターに取り付けます。胚の表面をビデオ顕微鏡で観察します。半導体レーザーによって生成された光ビームをガンの内部キャピラリーに通し、標的組織への照準に使用します。ガンのヘッドにある3つの入口に接続されたTitanチューブの独立したラインにより、単一のソースから加圧ヘリウムガスが供給されます。1本のラインは常に開放されており、ガン内にヘリウムガスを連続的に流します。他の2本のラインは通常、ソレノイドバルブで閉じており、チューブ内に充填された2種類の異なるコーティングを施した金粒子を含んでいます。乾燥粉末として使用します。ガンの外側キャピラリーを、ゲージ圧-12.5 PSIの真空システムに接続します。目的の粒子浸透深さに調整するため、hiのヘッド圧を10から15 PSIの間で変化させます。ヘリウムのヘッド圧力は粒子の浸透深さに大きく影響し、胚からガンまでの距離も同様に影響します。遺伝子ガンによって異なるノズルの直径は、ターゲット領域に合わせて適切に選択することが重要です。それでは、実験セットアップを説明しましたので、Jingガンに充填し、ゼブラフィッシュの胚にショットを行います。Titanチューブに充填する前に、コーティングされた金粒子が完全に乾燥していることが極めて重要です。まず、カバーガラスまたはカミソリを用いて、ガラススライドからコーティングされた金粒子を掻き出し、折り畳んだホエイペーパーに充填できる状態にします。チューブはコネクタに近い部分でU字型に曲げておきます。これにより、粒子を充填する際にチューブ全体に広がることなく、コネクタ付近に集中させることができます。小さなスパチュラまたはV字型に折った薬包紙で粒子をすくい取り、チューブに充填します。充填中は、指でチューブを軽く弾いて粒子を均等に分散させてください。チューブへの充填が完了したら、Jing gunを用いて二本鎖RNAを導入しますが、その前にヒルを準備します。ここでは、約10日経過したヒル胚を確認できます。胚は現在、二本鎖RNAの導入前後に使用する滅菌培地の中にあります。実験用胚を二本鎖RNA導入に向けて準備する最初のステップは、V字型の溝がある平らな柔軟性シリコン上に、滅菌培地で調製した8% ethanol溶液を加えることです。1個の胚を加え、粒子注入の直前に腹側を上にして配置します。チャンバー内の培地は胚の上端のわずかに下まで減らし、中央に小さな穴を開けたティッシュペーパーをその上に置いて、胚を固定し、表面の乾燥を防ぎます。同時に、本日使用する胚のステージにおいて標的とする領域のみを露出させます。ステージE 10では、縦走筋細胞は外表面から約10〜20 µm深さの、表皮、真皮、および環状筋の内側に位置しています。胚発生段階（本研究ではE7からE12を使用）の胚において、腹側の中心神経節は体表から約50 µmの深さに位置しており、これは筋細胞とは異なります。神経節よりも浅い位置にある縦走筋を標的にするため、ヘリウム圧を調整します。これで、金粒子を用いて縦走筋にショットを打つ準備が整いました。約0.5 mgの金粒子の充填量で、通常最大10回のショットに使用でき、1回のショットで通常数百個程度の粒子が導入されます。ショットは、バルブの1つを0.3秒間短時間開放することで生成され、これにより対応するチューブラインから粒子塊がガンボア内に注入されます。目的の組織領域をカバーするためには、多くの場合、複数回のショットが必要となります。粒子を脱落させ、ガンのボア内の連続ヘリウム流への注入を容易にするために、ショットの間にチューブを軽く叩きます。同一のアッセイで2番目の試薬を導入したい場合は、金粒子の導入直後に、別の粒子を2番目のチューブにロードすることができます。胚を人工池水に戻し（できれば1皿につき1個の胚）、RNAiまたは異所性発現が十分であると判断されるまで1〜3日間保持します。この間、胚は室温の暗室で保持されます。ここでは、narinのMr.NAノックダウンに関するin situハイブリダイゼーションアッセイについて説明します。処理された胚では、terrinを発現していない筋細胞がわずかに見られることがわかります。これらの筋肉には粒子が含まれています。粒子をterrin二本鎖RNAでコーティングすると、narinの発現が明らかにノックダウンされることがわかります。これは通常、細胞あたり1〜2個の粒子が含まれる細胞においてのみ起こりました。GFPをコードするプラスミドで粒子をコーティングし、使用している空気圧キャピラリーガンで核内に導入すると、神経細胞において蛍光が認められます。本デモンストレーションにおいて、私たちは標的領域の細胞に検出可能な損傷を与えることなく、生存胚の小さな局所領域にある細胞に両方の粒子を導入することができました。また、ノマディック・キャピラリーガンを用いることで、包括的な導入技術を実現し、3次元的に限定された組織の微小領域において、組織への検出可能な損傷なしに高精度に標的を絞り、遺伝子のノックインおよびノックダウンを行うという新たな能力を提示しました。以上となります。ご視聴ありがとうございました。皆様の実験の成功をお祈りいたします。

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Research

JoVE Journal

Biology

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