生物学的抽出フィールドキットとフィールドqPCRユニットを用いた現地での微生物DNA解析

私たちの研究の範囲は、修復、採掘、腐食防止に関与する微生物の特性評価に利用できる分子分析を含み、持続可能性に関する疑問に答えるのに大いに役立ちます。本研究は、信頼性が高く現場に持ち運び可能な分子生物学的ワークフローを用いて、多くの研究およびアクセスのギャップを埋めています。フィルターの両端をキャップを外し、ロッキングルアー接続で空気入りの3ミリリットルシリンジをフィルターに接続します。

空気を押し出して残留水分を排出します。注射器を外して、さらに空気を取り込んでから繰り返します。次に赤いコンセントキャップを再度キャップします。

溶液を逆さまにしてシリンジで混ぜます。ルアーのロッキングシリンジキャップを外し、ソリューションAシリンジをルアーのロッキングチップでカプセル化された0.2マイクロメートルのフィルター入口に接続します。プランジャーを押し込んで、ゆっくりと溶液Aを加えます。その後、閉じたフィルターを激しく手で5分間振ります。

次に溶液Bシリンジを何度か逆さにして混ぜます。ルーアーのロックキャップを外し、注射器をルアーのロック先端でカプセル化されたフィルター入口に接続します。インレットフィルターキャップを覆い直した後、閉じたフィルターを激しく手で5分間振ってください。

インレットキャップを外してフィルターを反逆にします。カプセル化されたフィルターユニットに取り付けた3ミリリットルのシリンジを使って、フィルター内に1ミリリットルの空気を押し込みます。その後、プランジャーを引いて溶解液をすべて取り除きます。

溶解液を5ミリリットルのビーズチューブに移します。パラフィルムで密封した後、ビーズチューブを激しく手で5分間振ってから立てて置きます。サンプル準備カートリッジを平らな面に置き、ルアーロック可能なカラムを1ミリリットルの注射器に接続します。

カラムの先端を使って、サンプル準備カートリッジの最初のセクションに2つの穴を開けます。ビーズチューブから溶離液1ミリリットルをカートリッジの最初の部分に新しく開けた穴にピペットで注ぎます。注射器のカラムをカートリッジの赤い部分に戻します。

その後、液体を完全に注射器に引き込み、10回押し出します。次に、注射器柱の先端を赤橙色の部分の上に置き、ホイルのバリアに2つの穴を開けます。プランジャーを使って、注射器の液体の全量を注射器の中に引き上げ、液体を完全にポンプで押し出します。

同様に、注射器の柱でオレンジ、黄色、青、自然乾燥、緑の各セクションを刺してポンプで送り込み、プランジャーをセクションに記載された回数だけ引っ張ったり押し込んだりします。その後、1ミリリットルの注射器とサンプル調製カラムを使って、緑色の部分からよくラベル付けされた1ミリリットルのマイクロチューブに溶液を移します。フィールドで抽出したDNAサンプルを最大3個、フィールドベースのqPCR機器の純粋なサンプルトレイロットに配置し、指定された区画ごとに1サンプルずつ確保します。

各サンプルのアッセイストリップをトレイの対応するA、B、またはCのスロットに挿入し、各ストリップの最初のウェルをトレイの最初のスロットに合わせます。電話のロックを解除し、商標登録されたqPCR機器の名前を冠したアプリケーションを開いてください。アプリケーションが開いたら、開始実行ボタンをタップしてください。

次の画面で「ID生成」ボタンをタップしてください。サンプルIDをタップし、サンプル名を入力してサンプル情報を入力してください。サンプルユニットをタップして適切なユニットを選択し、サンプル量をタップして抽出時に使用した体積を入力します。

すべてのサンプルの情報を入力した後、「続行」ボタンをタップします。次の画面でフォルダアイコンをタップし、次に「現在のフォルダに保存」をタップします。ラン名を入力して「確認」をタップします。

電源ボタンを長押しして全てのフロントライトが点灯するまで機器をオンにします。申請内で「確認」をタップして進めてください。アプリケーション内の内蔵短距離無線で接続ボタンを押してください。

楽器の内蔵短距離無線ボタンを押して青いライトが点滅するまで続けてください。次に「確認」をタップし、接続する楽器名を選択します。最初のサンプルのためにゴーストリップチューブのキャップを外します。

各井戸に18マイクロリットルの滅菌水を加え、優しくピペットでペレットを溶かします。各井戸に2マイクロリットルの試料を加え、チューブをゴム製のアッセイストリップキャップで密封し、正しい向きを確保します。すべてのストリップが準備できたら、アプリケーション内でタップ確認してください。

各アッセイストリップを取り除きます。井戸の底に泡がないか確認し、泡が上がるまで優しくストリップを揺らします。「確認」をタップして進めてください。

器具の蓋を開け、アッセイストリップを正しい順序と向きで器具に入れます。蓋を閉めてロックし、確認ボタンをタップします。アプリケーション内の「Start Run」ボタンをタップすると、ランを開始します。

ラン終了したら「メール結果」をタップしてください。ワイヤレスインターネットに接続したら、「再度送信」をタップして結果を送信します。ランの合間にトレイをしっかり清掃して汚染を防ぎましょう。

生物学的抽出フィールドキットを用いたDNA単離の成功は、検証済みの実験室ベース方法と比較して一貫したqPCR結果によって確認されました。フィールドベースのqPCRユニットを用いた標準培養希釈は、21度および30度の両温度で10回の繰り返しで低い偏差を示しました。フィールド計測機器の精密試験では、すべてのランで相対標準偏差が5%未満であることが示されました。

私たちの発見は、こうした遠隔地での環境モニタリングを可能にすることで、この分野を大きく前進させ、アクセスのしやすさやコミュニティの関与を促進し、非常に影響力のある科学的研究を生み出しています。私たちの結果は、輸送中のサンプルの変化と即時の抽出・分析の違いを理解する道を開きました。今後の研究では、塩水のような極端なサンプルや極端な気象条件に対するこれらの手法の限界を定義することに焦点を当てます。