マウスの筋肉および末端シュワン細胞におけるミトコンドリア形態の 現場 定量方法
2026年4月10日
ミトコンドリア染料標識の局所注射、シュワン細胞ミトコンドリアの生 体内 共焦点顕微鏡検査。この方法は、健康または病変したマウスの骨格筋組織で実証された概念実証を利用し、高解像度のミトコンドリア可視化を提供します。
本研究は、神経筋接合部における終末シュワン細胞のミトコンドリア形態を初めて調査しています。私たちのアプローチにより、毛細血管やリンパ床など、通常は入手が困難な組織におけるミトコンドリア形態の定量化が可能になります。まずは野生型とD2-mdxマウスを入手しましょう。
つまみ反射で麻酔の深さを確認した後、右膝の腱遠位に針を刺します。注射経路に沿って針を引き抜きながら、脛骨筋内側(TA)に2マイクロモルの遠赤蛍光ミトコンドリア染色50マイクロリットルを注入し、1時間体内で培養します。麻酔下で動物を維持しながら、安楽死前にハサミと鉗子を使ってTA筋を解離・分離してください。
分離したTA筋を室温の4%パラホルムアルデヒドに15分間浸します。その後、立体顕微鏡の下で繊維を優しく分離し、ゆっくりと導きます。細胞透過核酸染色を4%のパラホルムアルデヒドに加え、核標識用の最終濃度を5〜10マイクログラム/ミリリットルに得ます。
その後、TA筋肉をPBSで3回、それぞれ5分間洗い、余分な染料を落とします。筋肉を50%75%と100%エタノールでそれぞれ5分間ずつ順に脱水させます。その後、サンプルを組織クリア液1および2にそれぞれ30分間ずつ培養し、完全に浸かるようにします。
筋肉をカバースリップに置く。2.5×2×1センチのガラスブロック(重さ7.8グラム)を使って、優しく平らにします。S100ベータマウスを入手しましょう。
足のつまみ反射で麻酔の深さを確認した後、大臀筋(GM)の上に小さな皮膚切開をします。GM筋肉の下に2マイクロモルの遠赤蛍光ミトコンドリア染色を75マイクロリットル注入します。傷口を閉じ、染料を45分間培養して末端シュワン細胞を選択的に標識します。
麻酔下で動物を維持しながら、10分以内にGM筋肉を解剖し、直ちに冷やした0.9%滅菌生理食塩水に入れます。D2-mdxマウスを使用する場合のみ、蛍光アセチルコリン受容体染料を1対500の希釈でマイクロセクリーバスに加え、組織を30分間培養します。余分な脂肪と結合組織をトリミングし、GM筋肉を腹側を下に向けたカバースリップに移し、逆さ顕微鏡検査を行います。
GMの背面に一般的な取り付け媒体を2マイクロリットル加え、画像診断前にガラスブロックで組織を平らにします。ソフトウェアで励起波長を646ナノメートルに設定します。クリアリング溶液2を2滴加えた後、TA筋を撮影する63倍対物レンズを選択し、Zスタック深度を100マイクロメートル近くに設定します。
次に、デコンボリューションモードを選択し、システム最適化パラメータを適用します。ステップサイズを1マイクロメートルに設定し、画像を取得します。終端シュワンセルの画像を取得するには、20倍倍の対物レンズを選択し、Zスタック深度を約17マイクロメートルに設定して画像を取得します。
次に、63倍倍の対物レンズを選択し、個々の末端シュワンセルの画像を取得します。個々のZスライスをインポートして、ソフトウェアがミトコンドリア信号を認識するように訓練します。AI駆動のソフトウェアを用いて定量分析を行うこと。
調査員のレビュー用画像マスクを作成します。アルゴリズム最適化後に3D画像スタックを個別の光学セクションに分離します。各3D画像から5分の1のZスライスを選択し、サンプルごとの平均値を計算します。
すべてのサンプルでイメージングパラメータを標準化し、ミトコンドリア形態を定量化します。免疫組織化学および統計解析を行い、グループの違いと相関を評価します。mdx筋肉のミトコンドリア結合性は野生型マウスと比べて減少しました。
mdxマウスでは、小さなミトコンドリア断片の数が増え、大きく相互接続されたミトコンドリアネットワークの数が減少しました。野生型マウスでは、末端シュワン細胞のミトコンドリアが分岐部付近で相互に連結したループ構造を示しました。対照的に、mdxマウスではミトコンドリアは分岐部付近で断片化しループ形成を欠いていました。
共焦点顕微鏡および電子顕微鏡は、末端シュワン細胞に類似したドーナツ状のミトコンドリア構造が確認されました。シナプス後解析では、サブサルコレマルミトコンドリアがアセチルコリン受容体の周囲に集まり、特徴的なプレッツェル状構造を欠いていることが示されました。画像解析により、mdx筋の末端シュワン細胞ミトコンドリアは野生型筋と比較して面積と断片化が増加し、粒子サイズの相対的な差は見られませんでした。
筋力測定では、mdx筋肉の筋肉における反発が減少し、変動が大きくピーク力が減少していることが示されました。刺激頻度の増加に伴う力の生成もMDX筋肉で有意に減少しました。mdx筋は繊維の大きさが左にずれており、野生型と比べて約60%小さな筋繊維が見られました。
このプロトコルにより、研究者は骨格筋および末端シュワン細胞におけるミトコンドリア形態を研究・定量化することが可能になります。今後の研究では、このアプローチを微小循環およびリンパ管におけるミトコンドリア形態の調査に応用できる可能性があります。
完全なトランスクリプトを表示し、数千本の科学動画にアクセス
概要
本プロトコールでは、マウスの骨格筋および終末シュワン細胞（tSC）の全層標本において、三次元的なミトコンドリアネットワーク形態を標識し定量化するための再現性のある手法を提示します。膜電位感受性ミトコンドリア色素を生体内に投与し、標準的な共焦点顕微鏡を用いることで、組織の破壊や解剖学的な複雑さに伴う課題を克服し、無傷の神経筋組織内におけるミトコンドリア構造の詳細な解析が可能になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 細胞・分子神経科学
- 筋肉生物学
- イメージングおよび顕微鏡法
背景
- ミトコンドリアネットワークの形態は、細胞の健康状態を示す重要な指標です。
- 未処理の組織においてミトコンドリア構造を定量化することは、技術的に困難です。
- 終末シュワン細胞（tSC）は、神経筋接合部の維持と再生に不可欠です。
- tSCはその位置および組織破壊への感受性のため、in situでの解析が困難です。
研究目的
- 全層骨格筋およびtSCにおけるミトコンドリア形態の標識および定量化のための再現可能なプロトコルを開発すること。
- 導入遺伝子レポーターや特殊なイメージングプラットフォームを必要とせずに、in situでミトコンドリアネットワークの解析を可能にすること。
- 健康な筋肉組織とジストロフィー筋肉組織の両方で本手法を検証すること。
使用された手法
- 膜電位感受性ミトコンドリア色素のin vivo導入。
- ミトコンドリア構造を保持するための迅速な組織処理。
- 三次元イメージングのための高解像度共焦点顕微鏡観察。
- ミトコンドリアネットワークの接続性、面積、および断片化を定量化するための画像スタック解析。
主な結果
- 本プロトコルにより、骨格筋のホールマウント標本およびtSCにおけるミトコンドリアネットワークの標識と定量化に成功した。
- ジストロフィー筋および健常筋での検証により、ミトコンドリア形態における想定通りの差異が確認された。
- 本手法は、S100βリポーターマウスを用いることでtSCにも適応可能である。
- 解析は、大学のコアファシリティで一般的に利用可能な設備を用いて実施できる。
結論
- この手法により、無傷の神経筋肉組織におけるミトコンドリア形態の詳細な解析が可能になります。
- これにより、トランスジェニックなミトコンドリアリポーターや特殊なイメージングプラットフォームが不要になります。
- 本プロトコルは、その他の薄い組織や表面からアクセス可能な組織にも適用可能です。
よくある質問
業界における重要性
筋肉および末梢シュワン細胞におけるミトコンドリア形態の定量的in situ解析は、神経筋疾患および代謝疾患研究における早期発見とターゲット検証の重要な空白を埋めるものです。本プロトコルにより、無処置組織内におけるミトコンドリアネットワークの完全性を、ハイスループットかつ再現性高く評価することが可能となり、疾患関連モデルにおける予測信頼性の向上と、リスク調整後のポートフォリオ決定を促進します。また、標準的なイメージングインフラストラクチャとの互換性により、R&Dチーム全体でのアクセシビリティと拡張性が向上します。
バイオファーマ研究開発における戦略的応用
早期発見とターゲット検証
- 生理学的に適切な組織環境において、ミトコンドリアネットワークの状態を直接的に評価することが可能です。
- 疾患モデルおよび対照モデルにおけるネットワークの連結性、面積、断片化を定量化することで、機能的なターゲット検証をサポートします。
- 健常筋肉とジストロフィー筋肉におけるミトコンドリアの表現型を区別することで、メカニズム解明によるリスク低減を促進します。
- 仮説駆動型のパスウェイ解析のための定量的なエンドポイントを提供します。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- ホールマウント組織におけるミトコンドリア形態の、検証済みイメージングおよび定量化ワークフローを確立する。
- アッセイの標準化や研究間比較に適した、再現性のある定量的な出力を提供する。
- アクセス可能な組織システムにおいて、ミトコンドリアダイナミクスに影響を与える介入のスクリーニングを可能にする。
- トランスジェニックレポーターに依存せず、複数の組織タイプにわたるプラットフォームの再利用をサポートする。
トランスレーショナル・前臨床研究
- ミトコンドリア形態のエンドポイントを疾患に関連する組織コンテキストと整合させ、トランスレーショナルなバイオマーカー開発を可能にする。
- 筋肉細胞とシュワン細胞の両方での解析を可能にすることで、発見から前臨床検証までの連続性を維持する。
- ミトコンドリア標的治療薬の進展に寄与する、リスク調整済みデータを提供する。
- その他の薄い組織や表層からアクセス可能な組織への適応を容易にし、より広範なトランスレーショナルな影響をもたらす。
パイプラインおよびワークフローの統合
この手法は、無傷の組織においてミトコンドリア形態の堅牢な定量化を可能にすることで、創薬標的の探索から前臨床への連続的なプロセスに組み込まれ、初期のターゲットバリデーションと後続のトランスレーショナルリサーチの両方を支援します。
- 探索生物学：ミトコンドリアネットワークの特徴を直接測定することにより、仮説検証およびメカニズムのデリスキングを支援します。
- スクリーニング：アッセイ開発および化合物評価のための、標準化された定量的なイメージング出力を提供します。
- 分析：実験条件間の比較分析のために、ネットワークの接続性、面積、および断片化の指標を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：疾患関連組織におけるバイオマーカーの整合を可能にすることで、探索段階と前臨床段階を橋渡しします。
- エンタープライズでの再利用：標準的な共焦点顕微鏡プラットフォームと互換性のある、汎用性の高いワークフローを提供します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ミトコンドリア研究における予測の信頼性を高め、メカニズムの曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：広く普及しているイメージング・インフラストラクチャを用いることで、再現性と拡張性を促進します。
- 戦略的価値：堅牢で定量的なエンドポイントを提供することで、go/no-go判断の精度を向上させ、資本効率を高めます。
- ポートフォリオへの影響：疾患領域を横断して、ミトコンドリア標的プログラムのリスク調整後の優先順位付けを支援します。
実施上の検討事項
- 共焦点顕微鏡および定量的な画像解析に関する専門知識が必要です。
- コアファシリティで一般的に使用されている標準的な膜電位感受性色素およびイメージングプラットフォームを利用します。
- 再現性を確保するため、組織処理およびイメージングプロトコルのチーム間での標準化が求められます。
- プロトコルをわずかに変更することで、他の薄い組織や表面からアクセス可能な組織にも適用可能です。
- 最適な結果を得るには、組織へのアクセス可能性および色素の適合性に依存します。
