マウスの筋肉および末端シュワン細胞におけるミトコンドリア形態の 現場 定量方法
2026年4月10日
ミトコンドリア染料標識の局所注射、シュワン細胞ミトコンドリアの生 体内 共焦点顕微鏡検査。この方法は、健康または病変したマウスの骨格筋組織で実証された概念実証を利用し、高解像度のミトコンドリア可視化を提供します。
本研究は、神経筋接合部における終末シュワン細胞のミトコンドリア形態を初めて調査しています。私たちのアプローチにより、毛細血管やリンパ床など、通常は入手が困難な組織におけるミトコンドリア形態の定量化が可能になります。まずは野生型とD2-mdxマウスを入手しましょう。
つまみ反射で麻酔の深さを確認した後、右膝の腱遠位に針を刺します。注射経路に沿って針を引き抜きながら、脛骨筋内側(TA)に2マイクロモルの遠赤蛍光ミトコンドリア染色50マイクロリットルを注入し、1時間体内で培養します。麻酔下で動物を維持しながら、安楽死前にハサミと鉗子を使ってTA筋を解離・分離してください。
分離したTA筋を室温の4%パラホルムアルデヒドに15分間浸します。その後、立体顕微鏡の下で繊維を優しく分離し、ゆっくりと導きます。細胞透過核酸染色を4%のパラホルムアルデヒドに加え、核標識用の最終濃度を5〜10マイクログラム/ミリリットルに得ます。
その後、TA筋肉をPBSで3回、それぞれ5分間洗い、余分な染料を落とします。筋肉を50%75%と100%エタノールでそれぞれ5分間ずつ順に脱水させます。その後、サンプルを組織クリア液1および2にそれぞれ30分間ずつ培養し、完全に浸かるようにします。
筋肉をカバースリップに置く。2.5×2×1センチのガラスブロック(重さ7.8グラム)を使って、優しく平らにします。S100ベータマウスを入手しましょう。
足のつまみ反射で麻酔の深さを確認した後、大臀筋(GM)の上に小さな皮膚切開をします。GM筋肉の下に2マイクロモルの遠赤蛍光ミトコンドリア染色を75マイクロリットル注入します。傷口を閉じ、染料を45分間培養して末端シュワン細胞を選択的に標識します。
麻酔下で動物を維持しながら、10分以内にGM筋肉を解剖し、直ちに冷やした0.9%滅菌生理食塩水に入れます。D2-mdxマウスを使用する場合のみ、蛍光アセチルコリン受容体染料を1対500の希釈でマイクロセクリーバスに加え、組織を30分間培養します。余分な脂肪と結合組織をトリミングし、GM筋肉を腹側を下に向けたカバースリップに移し、逆さ顕微鏡検査を行います。
GMの背面に一般的な取り付け媒体を2マイクロリットル加え、画像診断前にガラスブロックで組織を平らにします。ソフトウェアで励起波長を646ナノメートルに設定します。クリアリング溶液2を2滴加えた後、TA筋を撮影する63倍対物レンズを選択し、Zスタック深度を100マイクロメートル近くに設定します。
次に、デコンボリューションモードを選択し、システム最適化パラメータを適用します。ステップサイズを1マイクロメートルに設定し、画像を取得します。終端シュワンセルの画像を取得するには、20倍倍の対物レンズを選択し、Zスタック深度を約17マイクロメートルに設定して画像を取得します。
次に、63倍倍の対物レンズを選択し、個々の末端シュワンセルの画像を取得します。個々のZスライスをインポートして、ソフトウェアがミトコンドリア信号を認識するように訓練します。AI駆動のソフトウェアを用いて定量分析を行うこと。
調査員のレビュー用画像マスクを作成します。アルゴリズム最適化後に3D画像スタックを個別の光学セクションに分離します。各3D画像から5分の1のZスライスを選択し、サンプルごとの平均値を計算します。
すべてのサンプルでイメージングパラメータを標準化し、ミトコンドリア形態を定量化します。免疫組織化学および統計解析を行い、グループの違いと相関を評価します。mdx筋肉のミトコンドリア結合性は野生型マウスと比べて減少しました。
mdxマウスでは、小さなミトコンドリア断片の数が増え、大きく相互接続されたミトコンドリアネットワークの数が減少しました。野生型マウスでは、末端シュワン細胞のミトコンドリアが分岐部付近で相互に連結したループ構造を示しました。対照的に、mdxマウスではミトコンドリアは分岐部付近で断片化しループ形成を欠いていました。
共焦点顕微鏡および電子顕微鏡は、末端シュワン細胞に類似したドーナツ状のミトコンドリア構造が確認されました。シナプス後解析では、サブサルコレマルミトコンドリアがアセチルコリン受容体の周囲に集まり、特徴的なプレッツェル状構造を欠いていることが示されました。画像解析により、mdx筋の末端シュワン細胞ミトコンドリアは野生型筋と比較して面積と断片化が増加し、粒子サイズの相対的な差は見られませんでした。
筋力測定では、mdx筋肉の筋肉における反発が減少し、変動が大きくピーク力が減少していることが示されました。刺激頻度の増加に伴う力の生成もMDX筋肉で有意に減少しました。mdx筋は繊維の大きさが左にずれており、野生型と比べて約60%小さな筋繊維が見られました。
このプロトコルにより、研究者は骨格筋および末端シュワン細胞におけるミトコンドリア形態を研究・定量化することが可能になります。今後の研究では、このアプローチを微小循環およびリンパ管におけるミトコンドリア形態の調査に応用できる可能性があります。
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Overview
This protocol presents a reproducible method for labeling and quantifying three-dimensional mitochondrial network morphology in whole-mount skeletal muscle and terminal Schwann cells (tSCs) in mice. Utilizing in vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye and standard confocal microscopy, the approach enables detailed analysis of mitochondrial architecture within intact neuromuscular tissues, overcoming challenges associated with tissue disruption and anatomical complexity.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular neuroscience
- Muscle biology
- Imaging and microscopy
Background
- Mitochondrial network morphology is a key indicator of cellular health.
- Quantifying mitochondrial architecture in intact tissues is technically challenging.
- Terminal Schwann cells (tSCs) are critical for neuromuscular junction maintenance and regeneration.
- tSCs are difficult to analyze in situ due to their location and sensitivity to tissue disruption.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for labeling and quantifying mitochondrial morphology in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- To enable analysis of mitochondrial networks in situ without the need for transgenic reporters or specialized imaging platforms.
- To validate the method in both healthy and dystrophic muscle tissue.
Methods Used
- In vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye.
- Rapid tissue processing to preserve mitochondrial structure.
- High-resolution confocal microscopy for three-dimensional imaging.
- Image stack analysis to quantify mitochondrial network connectivity, area, and fragmentation.
Main Results
- The protocol successfully labels and quantifies mitochondrial networks in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- Validation in dystrophic and healthy muscle confirms expected differences in mitochondrial morphology.
- The method is adaptable to tSCs using S100β reporter mice.
- Analysis can be performed using equipment commonly available in university core facilities.
Conclusions
- This approach enables detailed analysis of mitochondrial morphology in intact neuromuscular tissues.
- It eliminates the need for transgenic mitochondrial reporters or specialized imaging platforms.
- The protocol is adaptable to other thin or superficially accessible tissues.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ analysis of mitochondrial morphology in muscle and terminal Schwann cells addresses a critical gap in early discovery and target validation for neuromuscular and metabolic disease research. This protocol enables high-content, reproducible assessment of mitochondrial network integrity within intact tissues, supporting predictive confidence in disease-relevant models and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. Its compatibility with standard imaging infrastructure enhances accessibility and scalability across R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mitochondrial network health in physiologically relevant tissue environments.
- Supports functional target validation by quantifying network connectivity, area, and fragmentation in disease and control models.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing mitochondrial phenotypes in healthy versus dystrophic muscle.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging and quantification workflows for mitochondrial morphology in whole-mount tissues.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and cross-study comparison.
- Enables screening of interventions affecting mitochondrial dynamics in accessible tissue systems.
- Supports platform reuse across multiple tissue types without reliance on transgenic reporters.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology endpoints with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis in both muscle and Schwann cells.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement of mitochondrial-targeted therapeutics.
- Facilitates adaptation to additional thin or superficially accessible tissues for broader translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust mitochondrial morphology quantification in intact tissues, supporting both early target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking through direct measurement of mitochondrial network features.
- Screening: Provides standardized, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers network connectivity, area, and fragmentation metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable workflow compatible with standard confocal microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Promotes reproducibility and scalability using widely available imaging infrastructure.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mitochondrial-targeted programs across disease areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Utilizes standard membrane potential–sensitive dyes and imaging platforms common to core facilities.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to other thin or superficially accessible tissues with minimal protocol modification.
- Dependent on tissue accessibility and dye compatibility for optimal results.
