機能と構造が保存された体内ヒト滑膜 組織を用いた前 臨床モデル

主な質問は、感染性および炎症性刺激に対する固有の滑膜免疫反応は何か、そしてそれが滑膜構造の変化にどのように反映されるかということです。私の主な臨床および研究の焦点は、重度の肥満患者の末期RC関節炎の治療です。この患者集団では、彼らの疾患に対する外科的治療選択肢を見つけるのに困難があるため、しばしば医学的に放置されています。

始めに、手術室で関節切開と解剖を行います。標準的な内側膝蓋骨横断アプローチを使用し、重度の肥満と末期性関節炎の患者を手術する際には、より広範囲の露出を行います。前方滑膜を特定し、電気焼灼を用いて組織を解剖します。

炎症の兆候がないか膝を観察します。肥満患者は、肥満のより広範囲な炎症効果と相関する局所的な炎症反応を示す場合があります。滅菌された方法で滑膜を研究チームメンバーに渡します。冷たいDulbecco's PBSまたはDPBSで満たされた容器を氷の上に置き、全膝関節置換術中に得られたヒトの前方滑膜組織を容器に移します。

プレートロッカー上で10分間、冷たいDPBSで組織を2回洗浄します。次に、10センチメートル以上のサイズの滅菌されたペトリ皿の下に滑膜を移動させます。生物安全レベル2キャビネットの下に、ナトリウムピルビン酸およびL-グルタミンを含む冷たい滅菌低グルコースDMEMを加え、皿を半分まで満たします。

真珠光沢のある内膜層で滑膜の内層を特定し、それを剥がさずにおきます。少なくとも2回の技術的複製のために3ミリメートルの生検コアを得るために必要なツールを配置します。虹彩はさみまたはメスを使用して、焼灼面から余分な脂肪と間質組織を切り離し、滑膜を分離します。全体を通して組織の深さを約4～5ミリメートルに保ちます。

必要に応じてペトリ皿の培地を交換し、視野を維持します。滑膜の内層がコーリングツールに向くように組織を配置します。非支配手で鉗子または止血鉗子を使用して組織を安定させ、強い垂直圧力と穏やかなねじりをかけることで組織をコアリングします。

生検パンチを約10～15回使用した後、またはコアリング中に組織がねじれる場合に交換し、内膜の構造を傷つけないようにします。2番目のペトリ皿を開き、37度セルシウスで調温した10%FBSを含む培地を5～10ミリリットル入れます。平らなまたは非歯のある鉗子を使用して、コアを皿に移し、ピンチを強くせずにデブリを洗い流すために1～2秒間穏やかに攪拌します。

関節空間分析システムの下部ウェルを準備するために、37度セルシウスで調温した10%FBSを含む低グルコースDMEMを600マイクロリットル加えます。下部ウェルに、車両コントロールまたは選択した処理試薬、例えばLPSまたはMCP-1を加えます。望ましい実験結果に基づいてトランスウェルポーサイズを選択し、トランスウェルに300マイクロリットルの低グルコースDMEMと10%FBSを加えます。

滅菌鉗子を使用して、チリと浮遊するコアを避けて、トランスウェルの培地に個々の組織コアを優しく移します。次に、下流で実行するアッセイに応じて、37度セルシウスで5%炭酸ガスのインキュベーターに8～72時間アセンブリを配置します。滑膜組織を10%中性緩衝ホルマリンで固定します。

次に、組織を埋め込み、組織学的分析のために切片にします。ヘマトキシリン・エオジン染色後、明視野顕微鏡で10倍と40倍で組織切片を画像化します。Photoshopを使用して、40倍のTIFF画像で内膜の内層と下層領域を輪郭を描き、標的外領域、赤血球、大きな血管をマスクし、その後の定量分析のために隠します。

最終的なマスクを分析して、内膜の内層と下層の厚さ、完全性、細胞性を定量化します。最後に、フローサイトメトリーで遊走細胞を評価し、収集した培地の可溶性因子を酵素結合免疫吸着測定法で評価します。増加するMCP-1またはLPSで培養した滑膜組織は、対照と比較して、脆弱な内膜の内層と細胞密度の低下した厚くなった内膜の内層など、明確な内膜の内層の形態変化を示しました。

MCP-1とLPS処理は滑膜のサイトカイン反応を変化させました。MCP-1は下層で病原性線維芽細胞マーカーのポドプラニン発現を誘導しましたが、LPSは内膜の内層と下層の両方でポドプラニンを増加させました。底部ウェルに含まれる遊走性免疫細胞には、好中球、NK細胞、NKT細胞、T細胞、B細胞、または樹状細胞、単球、マクロファージ、およびM2マクロファージが含まれていました。

遊走性免疫細胞の中でT細胞が最も多かったです。統計的に、底部ウェルの刺激に基づく細胞移動に違いはありませんでした。関節炎関連タンパク質であるオステオプロテゲリンは、未処理の培養関節炎滑膜で24、48、72時間で検出され、72時間で24時間よりも有意に高かった。

内膜の内層における誘導性一酸化窒素合成酵素の発現は、0時間の対照で高く、24時間後にほぼ消失しました。N-アセチルシステインで処理した場合、一酸化窒素合成酵素の発現は維持されました。逆に、N-アセチルシステインは一酸化窒素合成酵素の発現を変化させず、これは滑膜炎および潜在的な軟骨損傷のマーカーです。

このプロトコルにより、研究者は滑膜の内膜および下層の変化を研究することができ、深さ、細胞性、完全性が含まれ、これらはすべて炎症を示しています。このプロトコルを実行する際の最も重要な考慮事項は、適切なドナーからの生存組織の取得、無菌性、および生検選択のための内膜の内層の特定です。将来の研究では、滑膜の内膜の内層の再生を評価するために、生存組織培養の長さを改善することを確認します。