Name: 機能と構造が保存された体内ヒト滑膜 組織を用いた前 臨床モデル (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-03-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: 学ぶJSASを用いたヒト滑膜組織の前臨床モデル構築法。炎症性・感染性刺激に対する急性応答を解析し、関節炎研究における組織構造と機能の保存を実現します。

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<table><tbody><tr><td>10 cm ペトリ皿</td><td>Corning</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>23srRNA RNAscope プローブ</td><td>ACD/Biotechne</td><td>468211</td><td></td></tr><tr><td>24ウェルプレート</td><td>Life Sciences</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>3 mm 生検パンチ</td><td>Integra</td><td>12460406</td><td></td></tr><tr><td>50 mL コニカル</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>70% エタノール（滅菌用）</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Borrelia burgdorferi</td><td>ATCC</td><td>35210&nbsp;</td><td>最大の病原性を示すために、後期指数増殖期で使用する必要があります</td></tr><tr><td>BSK-H</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8291</td><td></td></tr><tr><td>CD68 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>14-0688-82</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>CO2 タンク（標準条件）</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's リン酸緩衝生理食塩水（Ca-/Mg-）</td><td>Thermofisher</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>胎児ウシ血清</td><td>Biotechne</td><td>S11150</td><td>熱不活化 ロット：F22100</td></tr><tr><td>鈍刃鉗子</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ヘモスタット</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>加湿セルインキュベーター（標準条件）</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低酸素インキュベーター</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>低酸素タンク（5% O2, 5% CO2, 残り N2, 生理的条件）</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IL-4 抗体</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-42470</td><td>1:100</td></tr><tr><td>iNOS 抗体</td><td>Thermofisher</td><td>PA1-036</td><td>1:100</td></tr><tr><td>虹彩鉗子</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>リポポリサッカライド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2630</td><td></td></tr><tr><td>低グルコース DMEM（+ナトリウムピルビン酸、+L-グルタミン）</td><td>Life Technologies</td><td>11885084</td><td></td></tr><tr><td>MMP9 抗体</td><td>Thermofisher</td><td>MA5-32705</td><td>1:1000</td></tr><tr><td>モジュラーインキュベーターチャンバー（高酸素条件）</td><td>Emrbient, Inc</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>モノサイトケモアトラクタントプロテイン 1</td><td>Peptrotech</td><td>300-04-20UG</td><td></td></tr><tr><td>N-アセチルシステイン</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9165</td><td>各実験で新たに調製し、等モル量の重炭酸ナトリウムでpH 7-7.4にバッファーすることが必要です</td></tr><tr><td>OPG ELISA</td><td>Millipore</td><td>RAB0484</td><td>1:1 希釈</td></tr><tr><td>リットル毎分フローレギュレーター付き酸素タンク</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDPN 抗体</td><td>Invitrogen</td><td>14-9381-82</td><td>1:100</td></tr><tr><td>プロピジウムヨウ化物</td><td>Thermofisher</td><td>J66764.MC</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope マルチプレックス蛍光V2アッセイ</td><td>ACD/Biotechne</td><td>323100</td><td></td></tr><tr><td>sRANKL ELISA</td><td>MyBioSource</td><td>MBS262624</td><td>1:1 希釈</td></tr><tr><td>Staphylococcus aureus USA 300 MRSA</td><td>ATCC</td><td>BAA-1717</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green</td><td>Thermofisher</td><td>S7563</td><td>10,000X ストック</td></tr><tr><td>TNF 抗体</td><td>Thermofisher</td><td>PA5-19810</td><td>1:100</td></tr><tr><td>トランスウェルインサート - 0.4 μm サイズ</td><td>Millicell</td><td>PICM01250</td><td></td></tr><tr><td>トランスウェルインサート - 5 μm サイズ</td><td>Corning</td><td>CLS3421</td><td></td></tr></tbody></table>

機能と構造が保存された体内ヒト滑膜 組織を用いた前 臨床モデル

A Pre-Clinical Model of Synovitis Using Ex vivo Human Synovial Tissue with Preserved Function and Architecture

酸素培養条件の最適化
生理学的組織灌流は約6%〜8%の酸素であり、細胞培養の標準的な培養条件は大気中の酸素濃度(~21%)である16。比較すると、過酸素化は細胞培養の生存率を高める場合もあれば、毒性を持つ場合もあります。JSASの適切な利用は滑膜組織の生存可能性の早期判断を必要としました。したがって、アポトーシスは0日目、1日目、2日目、3日目、5日目、7日目にカスパーゼ3免疫組織化学または免疫蛍光法で、生理的(5%O2)、大気/標準(21% O2)、および高酸素(50% O2)の3つの酸素条件下で評価されました。アポトーシスは標準的な潜伏条件下で3日目に始まり、5日目にピークに達しました。過酸素および低酸素状態の両方で、アポトーシスは1日目から2日目に確認され、5日目にピークに達しました。このため、さらなる実験には標準的なインキュベーション条件が選択されました(<strong class...

Arthritis is an inflammatory state within joints resulting in cartilage damage, pain, and loss of mobility. Recent advances in arthritis research ...

主な質問は、感染性および炎症性刺激に対する固有の滑膜免疫反応は何か、そしてそれが滑膜構造の変化にどのように反映されるかということです。私の主な臨床および研究の焦点は、重度の肥満患者の末期RC関節炎の治療です。この患者集団では、彼らの疾患に対する外科的治療選択肢を見つけるのに困難があるため、しばしば医学的に放置されています。始めに、手術室で関節切開と解剖を行います。標準的な内側膝蓋骨横断アプローチを使用し、重度の肥満と末期性関節炎の患者を手術する際には、より広範囲の露出を行います。前方滑膜を特定し、電気焼灼を用いて組織を解剖します。炎症の兆候がないか膝を観察します。肥満患者は、肥満のより広範囲な炎症効果と相関する局所的な炎症反応を示す場合があります。滅菌された方法で滑膜を研究チームメンバーに渡します。冷たいDulbecco's PBSまたはDPBSで満たされた容器を氷の上に置き、全膝関節置換術中に得られたヒトの前方滑膜組織を容器に移します。プレートロッカー上で10分間、冷たいDPBSで組織を2回洗浄します。次に、10センチメートル以上のサイズの滅菌されたペトリ皿の下に滑膜を移動させます。生物安全レベル2キャビネットの下に、ナトリウムピルビン酸およびL-グルタミンを含む冷たい滅菌低グルコースDMEMを加え、皿を半分まで満たします。真珠光沢のある内膜層で滑膜の内層を特定し、それを剥がさずにおきます。少なくとも2回の技術的複製のために3ミリメートルの生検コアを得るために必要なツールを配置します。虹彩はさみまたはメスを使用して、焼灼面から余分な脂肪と間質組織を切り離し、滑膜を分離します。全体を通して組織の深さを約4～5ミリメートルに保ちます。必要に応じてペトリ皿の培地を交換し、視野を維持します。滑膜の内層がコーリングツールに向くように組織を配置します。非支配手で鉗子または止血鉗子を使用して組織を安定させ、強い垂直圧力と穏やかなねじりをかけることで組織をコアリングします。生検パンチを約10～15回使用した後、またはコアリング中に組織がねじれる場合に交換し、内膜の構造を傷つけないようにします。2番目のペトリ皿を開き、37度セルシウスで調温した10%FBSを含む培地を5～10ミリリットル入れます。平らなまたは非歯のある鉗子を使用して、コアを皿に移し、ピンチを強くせずにデブリを洗い流すために1～2秒間穏やかに攪拌します。関節空間分析システムの下部ウェルを準備するために、37度セルシウスで調温した10%FBSを含む低グルコースDMEMを600マイクロリットル加えます。下部ウェルに、車両コントロールまたは選択した処理試薬、例えばLPSまたはMCP-1を加えます。望ましい実験結果に基づいてトランスウェルポーサイズを選択し、トランスウェルに300マイクロリットルの低グルコースDMEMと10%FBSを加えます。滅菌鉗子を使用して、チリと浮遊するコアを避けて、トランスウェルの培地に個々の組織コアを優しく移します。次に、下流で実行するアッセイに応じて、37度セルシウスで5%炭酸ガスのインキュベーターに8～72時間アセンブリを配置します。滑膜組織を10%中性緩衝ホルマリンで固定します。次に、組織を埋め込み、組織学的分析のために切片にします。ヘマトキシリン・エオジン染色後、明視野顕微鏡で10倍と40倍で組織切片を画像化します。Photoshopを使用して、40倍のTIFF画像で内膜の内層と下層領域を輪郭を描き、標的外領域、赤血球、大きな血管をマスクし、その後の定量分析のために隠します。最終的なマスクを分析して、内膜の内層と下層の厚さ、完全性、細胞性を定量化します。最後に、フローサイトメトリーで遊走細胞を評価し、収集した培地の可溶性因子を酵素結合免疫吸着測定法で評価します。増加するMCP-1またはLPSで培養した滑膜組織は、対照と比較して、脆弱な内膜の内層と細胞密度の低下した厚くなった内膜の内層など、明確な内膜の内層の形態変化を示しました。MCP-1とLPS処理は滑膜のサイトカイン反応を変化させました。MCP-1は下層で病原性線維芽細胞マーカーのポドプラニン発現を誘導しましたが、LPSは内膜の内層と下層の両方でポドプラニンを増加させました。底部ウェルに含まれる遊走性免疫細胞には、好中球、NK細胞、NKT細胞、T細胞、B細胞、または樹状細胞、単球、マクロファージ、およびM2マクロファージが含まれていました。遊走性免疫細胞の中でT細胞が最も多かったです。統計的に、底部ウェルの刺激に基づく細胞移動に違いはありませんでした。関節炎関連タンパク質であるオステオプロテゲリンは、未処理の培養関節炎滑膜で24、48、72時間で検出され、72時間で24時間よりも有意に高かった。内膜の内層における誘導性一酸化窒素合成酵素の発現は、0時間の対照で高く、24時間後にほぼ消失しました。N-アセチルシステインで処理した場合、一酸化窒素合成酵素の発現は維持されました。逆に、N-アセチルシステインは一酸化窒素合成酵素の発現を変化させず、これは滑膜炎および潜在的な軟骨損傷のマーカーです。このプロトコルにより、研究者は滑膜の内膜および下層の変化を研究することができ、深さ、細胞性、完全性が含まれ、これらはすべて炎症を示しています。このプロトコルを実行する際の最も重要な考慮事項は、適切なドナーからの生存組織の取得、無菌性、および生検選択のための内膜の内層の特定です。将来の研究では、滑膜の内膜の内層の再生を評価するために、生存組織培養の長さを改善することを確認します。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

免疫学と感染症

アプリケーション制御の機械的負荷や衝撃の後そのままマウス関節の関節面の細胞傷害/死の空間範囲を評価する方法を提案します。このメソッドは、どのように変形性関節症、遺伝的要因や異なる負荷療法上皮内軟骨細胞の脆弱性に影響を調査するため使用できます。...

リアルタイム可視化と完全にそのままマウス軟骨外植片の機械的荷重により軟骨損傷の解析

ここでは、ウシの膝からの軟骨の切除と培養を記述するプロトコルを提示する。この方法は、関節を標的とする生物学的刺激または新規治療に応答して組織の変化を記述するための容易でアクセス可能なツールを提供する。...

牛膝剥離植物における軟骨改造のEx Vivo組織培養モデル

ここでは、マウス変形性関節症の確立された外科モデルを利用して、マウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織内の細胞外染色アッセイと細胞内染色アッセイの両方を使用して、単球/マクロファージおよびT細胞サブセットを同定するための詳細で再現可能なフローサイトメトリープロトコルについて述べた。...

変形性関節症モデルにおけるマウス脾臓、骨髄、リンパ節および滑膜組織における免疫細胞サブセットのフローサイトメトリー解析

ヒト間葉系幹細胞から4種類の組織を作製し、ヒト膝関節の軟骨、骨、脂肪パッド、滑膜を再現するための詳細な方法を提供します。これらの4つの組織は、カスタマイズされたバイオリアクターに統合され、マイクロ流体工学を介して接続されるため、膝関節オンチップが生成されます。...

関節疾患のモデリングと薬剤検査のための膝関節チップの作成

原子間力顕微鏡のマイクロインデンテーションに関連する最も一般的な問題を特定し、対処するための段階的なアプローチを紹介します。私たちは、変形性関節症によるさまざまな程度の変性を特徴とする天然のヒト関節軟骨外植片の新たな問題を例示しています。...

原子間力顕微鏡を用いたヒト関節軟骨外植片のマイクロインデンテーションにおける実用的課題への対処

本研究は、マウス炎症性関節炎組織から滑膜マクロファージおよび線維芽細胞を単離するための修正されたプロトコルを提供する。...

マウス関節炎組織からの初代滑膜マクロファージおよび線維芽細胞の単離と培養

ここでは、荷重を支える腱コア組織と、病気や損傷によって活性化された細胞集団を含む外因性区画との間の腱細胞のクロストークを模倣する集合体モデルシステムを紹介します。重要なユースケースとして、外因性内皮細胞の疾患関連活性化を調査するためにシステムをどのように展開できるかを示します。...

腱の集合体を工学的に研究し、疾患と修復における細胞のクロストークを探る

ここでは、SKGマウスからのCD4+...

マウスにおける関節リウマチの養子移植モデル

ここでは、げっ歯類に変形性膝関節症を誘発する信頼できるモデルとして、前十字靭帯 (ACL) を横断する外科的方法と、膝滑液を採取し、膝浮腫を測定し、変形性関節症の重症度を評価する方法論について説明します。...

関節の炎症と外傷後変形性関節症を研究するためのげっ歯類モデルにおける前十字靱帯切断と滑液洗浄

抗原特異的T細胞の誘導と拡大のための新しいDCの独立した方法が記載されている。 HLA A2 - Igはベースの人工的な抗原提示細胞（aAPC）が効率的に多様な抗原特異性のCTLを拡大するHLA -...

HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で</emヒトCTLの>拡大

学ぶJSASを用いたヒト滑膜組織の前臨床モデル構築法。炎症性・感染性刺激に対する急性応答を解析し、関節炎研究における組織構造と機能の保存を実現します。

機能と構造が保存された体内ヒト滑膜組織を用いた前臨床モデル

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