ジトニン透過化されたBE(2)-C神経芽細胞における酸化リン酸化結合のコリン作動位子依存性調節

本実験の全体的な目的は、選択的透過化と基質阻害剤の組み合わせを用いて、未開の培養神経芽細胞においてミトコンドリア生体エネルギー評価法を示すことです。伝統的に、ミトコンドリア呼吸はOroboros O2K高解像度呼吸計、クラーク型酸素電極、Seahorse XFアナライザーなどの機器を用いて評価されてきました。組織や細胞から分離または濃縮されたミトコンドリア画分に依存する従来の方法は、しばしばミトコンドリアの構造を損なうことがあります。

例えば、マウス皮質から分離されたミトコンドリアの透過電子顕微鏡画像は、ミトコンドリアがシナプス前末端に封じ込められているかどうかによって構造的な完全性に明確な違いがあることが明らかになります。シナプス前末端に包み込まれたミトコンドリアは、この写真のシアン色の矢印が示すように構造的に無傷に見えます。一方、膜構造が包まれていない、または周囲の膜構造が欠けているミトコンドリアは、黄色い矢印で示されるように変形しているように見えることが多いです。

シーホースフレックス分析装置は、培養細胞および単離ミトコンドリアの両方におけるミトコンドリア生体エネルギー学の研究に一般的に使用されています。培養細胞ベースの解析では、細胞構造やシグナル伝達ネットワークが保持されます。しかし、完全な細胞の細胞膜は多くのトリカルボン酸サイクル基質に対して不透過性を持っています。

これにより、単離ミトコンドリアに比べて代謝解析の範囲が制限されます。単離ミトコンドリアは形質膜障壁を持たず、構造的なアーティファクトを示すことが多いです。したがって、両システムには本質的な制約があります。ここで紹介する技術は、細胞膜がコレステロールを豊富に含むのに対し、ミトコンドリア膜は非常に少ないという事実を利用しています。

ディトニンのようなコレステロール結合洗剤を使用することで、ミトコンドリア膜をそのまま残しつつ、選択的に透過することができます。このアプローチにより、ミトコンドリア基質や阻害剤を細胞内に制御して侵入しつつ、オルガネラの完全性を損なうことなく行えます。したがって、この技術は全細胞構造の利点と単離ミトコンドリアアッセイの利用性を組み合わせ、完全な細胞の文脈でミトコンドリアの機能解析を可能にします。

実験は細胞のサブコンフルエント培養皿から始めます。細胞を無菌リン酸塩緩衝液で優しく洗浄し、細胞単一層を均一に覆うために適切な量のトリトン溶液を加えます。培養後、皿を取り出し、優しく叩いたり振ったりして細胞を外します。

5mlのピペットとピペットコントローラーを使い、細胞懸濁液を何度も上下にピペットさせて塊を砕き、単一の細胞懸濁液にします。顕微鏡で細胞懸濁液を調べて、均一な単一細胞懸濁液を確認します。ヘモサイトメーターや自動細胞計を使って細胞数を数えます。

100マイクロリットルの懸濁液に約10,000個の細胞を含むようにセル濃度を調整します。シーホースXFアッセイプレートの各ウェルにセル懸濁液100マイクロリットルを慎重に注入します。アッセイ中の背景制御として1本の井戸を空けておく。

細胞培養培養盤で2〜3時間培養し、細胞がウェルの底に付着するのを待つ。細胞が付着したら、各ウェルに優しく300マイクロリットルのアッセイ培地を加えます。プレートをインキュベーターに戻し、細胞が安定して成長するまで一晩培養してください。

各ウェルの底部にセルが均一な単一層を形成するようにしてください。過密状態を避けましょう。最適なアッセイ性能を確保するために、細胞はコンフルンであるべきですが、過剰に過重であってはいけません。

実験の前夜、XFp 24センサーカートリッジに各ウェルに1mlの校正バッファーを加えて水和します。あるいは、pH7.4のリン酸塩バッファー生理食塩水を使うこともできます。カートリッジはベッドの上で一晩室温のままにしておきましょう。

カートリッジは装填中に室温に平衡するため、37度の非COTインキュベーターでの培養は不要です。すべての凍結ストック溶液と室温のミクログリアアッセイバッファー2回を呼び出してください。pHを確認してください。7.4のはずです。

必要に応じて調整してください。すべての基質と注入液を準備し、再度pHを確認してください。使用まですべての溶液を氷に保存してください。

センサーカートリッジ注入ポート用の食品チューブをA、B、C、Dとラベル付けしたものを準備します。各ポートごとにそれぞれの阻害剤または基質を含む溶液を作るのが最善です。マルチチャネルピペットを使い、各注入ポートの溶液50マイクロリットルをそれぞれのポート(AからD)に慎重に注入します。

実験の1〜2時間前にシーホースバイオアナライザーを起動し、内部インキュベーターを37度で安定させます。各ウェルにラベルを付け、実験デザインとWave Desktop 2.6のガイドラインに従ってグループ分けしてください。バイオアナライザーを適切な混合、重量、測定サイクルにプログラムします。

参照は表8を参照してください。測定サイクルの開始時に平衡オプションを無効にすることが重要です。そのままにしておくと実験が不必要に長引くだけでなく、基質の消耗を招く可能性があります。

起動 機械はまずセンサーカートリッジのキャリブレーションを行い、約15分かかります。センサーカートリッジをキャリブレーションに入れた後、すぐにセルプレートの準備を始めてください。各接着細胞のあるウェルに約700マイクロリットルの1xミトコンドリアアッセイバッファーを散布し、1分間放置して平衡にします。

各ウェルからバッファーを慎重に吸引し、接着細胞を乱さないようにしてください。洗濯機の工程を3回繰り返して、完全にメディウムを保ちます。並行して、細胞のない背景井戸に50マイクロリットルのミトコンドリアアッセイバッファを追加します。

半月板をボリュームの一貫性の視覚的な基準として使います。細胞を含むウェルからバッファーを慎重に吸引し、約50マイクロリットルを残して細胞の水分を保ちます。プレートは37度の温度で培養し、水面上に保つ水浴、または蒸発を防ぐために飽和した空気を保った非鋼製インキュベーターで培養してください。

アナライザーに入れる直前に、必要に応じてアッセイ基質、阻害剤、または薬剤を含む予温ミトコンドリアアッセイバッファー450マイクロリットルを各ウェルに追加し、合計体積は500マイクロリットルにします。プレートは現在、シーホースバイオアナライザー内の校正済みセンサーカートリッジを使ってアッセイを実行する準備が整いました。まず、電子伝達系と酸化リン酸化の結合度を調べる結合アッセイを実施します。

この結合アッセイはミトコンドリア機能障害と機能障害を区別するのに役立ちます。このミトコンドリア電子伝達系の図では、複雑体1、3、5の特異的阻害剤と、ピルビン酸やマラート、スクシネートなど異なる基質のノードを示し、電子をシステムに提供します。この可視化は、アッセイの仕組みやさまざまな基質や阻害剤の役割を理解するのに役立ちます。

まず、5マイクロモルと10マイクロモールの2種類の濃度のジトニンを、細胞膜を通じた電子輸送を促進し、結合アッセイを可能にする効果を検証します。このアッセイでは、スクシネートを基質、ロテノンを複合一阻害剤として存在する状態で、酸素消費率を逐次測定して呼吸結合のレベルを評価しました。その後、ADP、オリゴマイシン、FCCP、アンチマイシンAを順次注射し、各注射後にOCR測定値を記録しました。

左パネルには、過渡的なマイクロチャンバー内の酸素張力の運動的線グラフが示されています。通常、この値はセンサーのダイナミックレンジ内で検出されるため、100〜200ミリメートルの水銀柱の間に保たれるべきです。これらのデータセットは、Agilent Waveソフトウェアのポイントツーポイントモードで生成され、測定期間中の一連のレートとしてOCRを表示し、動的変化を可視化できます。特に、10マイクロモルのジトニンが5マイクロモルに対してスクシネート輸送を増加させ、マイクロチャンバー内の酸素張力が低下し、それに伴い酸素の取り込み量が増加します。

これらの実験で得られたデータをプロットすると、2から4の複合体を介した基底呼吸は、5マイクロモルに比べて10マイクロモルのディジトニンで有意に多く、高濃度では透過性の高濃度で透過性の高プラズマ膜を通るスクシネート輸送がより効率的に行われていることが示されました。この観察に基づき、10マイクロモルのディトニンが最適な透過性をもたらすことから、基礎呼吸を下げるために細胞数を1井戸あたり20,000個に減らしました。この調整により、薬物や基質による呼吸増強がシステムの動的検出範囲内に収まることが保証されました。

ジトニン濃度と細胞数が最適化された後、次の結合アッセイでムスカリン作動薬およびアンタゴニストがミトコンドリア呼吸に与える影響を評価するために実施されました。この一連の実験で重要な発見の一つは、未処理のディトニン細胞において、スクシナ酸駆動の複合体2から4、およびState-3およびState-3uによる呼吸が有意に減少したことです。これは、スクシン酸が非透過条件下で細胞内に運ばれていないことを示しています。

複数の独立した実験データをプロットした結果、ムスカリン系抗体アトロピンは、神経芽腫細胞内の複合体2から4の複合体を介して媒介される基礎呼吸を有意に減少させ、ムスカリン作動薬アセチルコリンは高い呼吸レベルを維持していることが明らかになりました。さらに、State-3およびState-3uの呼吸は、非透過性細胞で透過性細胞よりも有意に低く、ミトコンドリア機能を損なうことなく細胞膜を選択的に透過させるディトニンの有効性を強調しています。電子フローアッセイは、電子がミトコンドリア電子伝達鎖に連続的に移動する様子を評価し、ミトコンドリアの機能障害や変調のメカニズムを特定するのに役立ちます。

アッセイの初期段階では、細胞にピルビン酸、マラー酸、FCCPを投与し、1から4の複合体によって駆動される高いレベルの非結合呼吸を誘導しました。その後のロテノン添加により複合体1が抑制され、基礎呼吸が減少し、複合体2から4の活性が分離されました。薬物治療状態と対照群の間で有意な差は観察されませんでしたが、重要な観察として、スクシネート駆動のState-3u呼吸は非透過性細胞で有意に低下し、ジジトニンが細胞へのスクシネート侵入を可能にする重要な役割を果たしていることが示されました。

まとめると、このプロトコルはミトコンドリアの生体エネルギー学を研究する信頼性の高い方法を提供します。これは、細胞全体の構造の生理学的意義と、単離ミトコンドリアアッセイの精度を組み合わせ、基質や阻害剤の制御された送達を可能にしつつ、オルガネルの完全性を保つことを可能にします。ディジトニン濃度と細胞密度を最適化することで、研究者は正確かつ再現性の高い測定を実現できます。

この柔軟なアプローチは、受容体媒介によるミトコンドリア機能の調節を探るのに理想的であり、疾患研究と創薬の強力なプラットフォームを提供します。