Caenorhabditis elegans L4幼虫全体におけるクロマチンアクセス性プロファイリング

私たちの研究は、エピジェネティック制御が遺伝子発現をどのように形成するか、特にクロマチンアクセシビリティが異なる生物学的条件下で遺伝子活性をどのように制御するかに焦点を当てています。C. elegansのATAC-seqは、その保護的なキューティクルによって制限されています。私たちのプロトコルは、この障壁を克服し、信頼性の高いクロマチンアクセシビリティ分析を可能にします。

まず、L1ワームの同期的な個体群を入手し、20度セルシウスで26時間成長させます。顕微鏡でほとんどのワームがL4段階にあることを確認します。M9バッファーでプレートからすべてのワームを回収し、1.5ミリリットルの遠心分離チューブに移します。

ワームを5回、1ミリリットルの滅菌水で重力によって沈殿させます。次に、ワームを含むチューブを25度セルシウスのインキュベーターに30分間入れ、腸内の食物残渣を取り除きます。その後、ワームペレットの50マイクロリットルを新しいチューブに移します。

ワームを裂くために、200マイクロリットルの新しいSDS-DTTバッファーを加え、チューブロテーターで5分間混合します。次に、1ミリリットルの冷たい卵バッファーを加えます。その後、ピコフュージで遠心分離し、上清を取り除き、6回繰り返します。

その後、80マイクロリットルの新鮮に調製したプロナーゼを加えます。200マイクロリットルのフィルター付きチップを備えたピペットを使用して、ワームとプロナーゼの混合物を70回混合し、室温で15分間インキュベートします。800マイクロリットルのL15 10％胎児牛血清培地を加え、4度セルシウスで500Gで5分間遠心分離します。

上清を除去した後、1ミリリットルのL15 10％胎児牛血清培地を加え、先ほど示したように遠心分離します。ペレットを3回洗浄した後、上清を取り除き、ペレットを900マイクロリットルのL15 10％胎児牛血清培地に再懸濁します。その後、20マイクロメーターのフィルターで懸濁液をろ過します。

ろ過した細胞懸濁液を4度セルシウスで500G、5分間遠心分離します。その後、上清を取り除き、約50マイクロリットルを残します。45マイクロリットルの新鮮に調製した溶解バッファーを加え、慎重にサンプルを再懸濁します。

その後、サンプルを混ぜずに50マイクロリットルの洗浄バッファーを慎重に加えます。4度セルシウスで500G、5分間遠心分離します。上清を取り除き、サンプルを氷上で保持します。

遠心分離している間に、サンプルごとにTN5ミックスを調製します。TN5バッファー25マイクロリットル、核酸フリー水24.8マイクロリットル、TN5酵素0.2マイクロリットルを組み合わせます。遠心分離後、上清を取り除き、核を氷上で保持します。核ペレットに50マイクロリットルのTN5ミックスを加えます。

その後、それを7回上下にピペットで混合します。37度セルシウスで30分間熱ブロック上でインキュベートし、10分ごとにチューブを優しくタップします。TN5インキュベーション後、PBバッファー300マイクロリットルを加え、最大速度で25秒間ボルテックスで混合します。

チューブから全容量をスピンカラムに移します。室温で1分間最大速度で遠心分離します。スピンカラムに750マイクロリットのPEバッファーを加え、再度遠心分離します。

その後、コレクションチューブで上清を廃棄します。空のスピンの後、カラムを新しい1.5ミリリットルのラベル付きチューブに入れます。37度セルシウスのEBバッファー10マイクロリットルをカラムの中央に、触れずに加えます。

室温で1分間放置します。その後、室温で最大速度で1分間遠心分離します。その後、溶出ステップを繰り返し、EBバッファーで最終的に20マイクロリットルの体積を得ます。

ATACライブラリー増幅の適切なサイクル増幅数を推定するためにリアルタイムPCRを行います。各サンプルについて、増幅信号が最大値の1/3に達するサイクルを選択して、最終増幅サイクル数を推定します。ATACライブラリーの最終増幅を行い、各サンプルに異なるリバースプライマーを割り当て、記録します。

各サンプルをそのサンプルの推定サイクル数で増幅します。200マイクロリットルのチューブで、総反応容積50マイクロリットルでDNAライブラリー10マイクロリットルを使用して、示されたポリメラーゼ連鎖反応を行います。プロトコルを一時停止する場合は、サンプルをマイナス20度セルシウスで保管します。

増幅したライブラリーを精製した後、毛細血管電気泳動を行い、断片サイズ分布パターンを確認します。最終ライブラリー増幅が15サイクル未満と推定される増幅曲線は、継続に適した良質な材料を示します。増幅曲線が遅延増加を示す場合は、質の悪い材料であり、継続すべきではありません。

増幅後の断片長分布は、有効なサンプルで約150塩基対および300塩基対で核小体パターンを示しました。スミアした断片パターンは、過剰に断片化されたDNAを示し、サンプルの繰り返しが必要でした。私たちのプロトコルは、全ワームでゲノムワイドなクロマチンアクセシビリティプロファイリングを可能にし、環境が遺伝子制御にどのように影響するかを理解します。

主要な課題は、不十分または過剰な断片化を避けるために、ワームの入力とTN5活性のバランスを取ることであり、最適なクロマチンアクセシビリティプロファイリングを確保します。このアプローチは、野生個体、環境条件、さらには代替種にわたるエピジェネティック変異を研究する機会を提供します。