パラホルマルデヒド固定マウス肝組織のレーザーキャプチャ顕微解剖によるRNA解析

私たちの研究は主に慢性肝疾患の文脈における肝細胞関連の病態生理を調査しています。このプロトコルにより、肝組織の細胞分離やRNA抽出が可能になります。FFPE(パラホルマルデヒド固定法やCTプロトコルの保存・反復処理)とは異なり、正確なマイクロ解析と高品質なサンプルの取得が可能で、下流のOMI分析が可能となります。

ペンメンブレンスライドを紫外線に曝露するには4分30分後に行きます。スライドに0.1ミリグラム/ミリリットルのポリLリジンを塗り、自然乾燥させます。各スライドの端をニュートラルな取り付け媒体で密封してください。

RNase除染剤を使い、クライオスタットのアクセス可能な表面とすべての工具を拭き取ります。75%エタノールを使っています。ブラシと工具をしっかり掃除してください。

次に、クライオスタットの温度をマイナス20度に設定し、安定させる。マイナス80度の貯蔵から肝臓サンプルを回収しろ。サンプルを少なくとも15分間クライオスタットチャンバーに入れて平衡させます。

試料ステージに厚さ2〜3ミリのOCT化合物を塗布します。その後、試料ステージをクイックフリーシェルフやクライオスタットチャンバー内に置き、化合物層を事前に固化させます。少量のOCT化合物を事前に固化した層に塗布した後、平衡化された組織ブロックを水平にその化合物の上に置き、10秒から15秒間そのまま保持します。

次に、組織ブロックを取り付けた試料ステージをクライオスタットの標本ヘッドに取り付けます。次に、ブレードをクランププレートと背面プレートの片側から慎重に挿入します。クランプレバーをクランプして刃を固定します。

クライオスタットの厚さ設定を10マイクロメートルに調整してください。組織を切片に切り、マイナス20度の温度で保温した冷凍保存室内の事前処理ペンメンブレンスライドに直接取り付けます。スライドを室温で20分間解凍します。

スライドはRN ACEフリーPBSで3回洗い、各洗い4回10秒ずつ行います。組織切片にフィルターしたマイヤーヘマトキシリン溶液を5秒から10秒間加えます。その後、リボヌクレアーゼフリーの水でスライドを3回洗い、各洗いごとに10秒間洗い、残留したヘマトキシリンを除去します。

顕微鏡で染色の質を評価してください。吸水性の紙を使ってスライドを吸い取り、完全に自然乾燥させます。実験台の表面をRNase除染剤で拭き取る。

コントローラーをオンにして顕微鏡の初期化を完了させます。キーをオフ位置からオン位置に時計回りに回転させてレーザーシステムを起動します。コンピューターを起動し、レーザー捕捉マイクロ解剖ソフトを起動します。

その後、初期化が完了するまで待ちます。次に、無菌の0.2ミリリットルPCRチューブを採取装置に挿入します。ピペットを使って、PCRチューブのキャップにプロテアーゼK消化バッファー10マイクロリットルを加えます。

採取装置を顕微鏡標本ホルダーに装填してください。チェンジコレクターデバイスウィンドウで。基準点を調整し、カメラのフォーカスを調整して基準点をはっきり見られ、必要なら矢印で中央に合わせます。

組織を下向きにして、標本ホルダーに組織の断片を装填します。10倍対物レンズを選択し、特定の病理的特徴を持つ関心領域を特定します。レーザーメニューに進みます。

キャリブレーションをクリックし、はいを選択してキャリブレーションを完了します。レーザー制御パネルでレーザー出力を50、絞りを5、速度を9に設定してください。次にグラフィックツールバーを使ってターゲットエリアの周りに円を描きます。

単一の形状を選択し、スタートカットを押してレーザー捕捉マイクロ解剖を行い、採集装置を配置して解剖組織を採取します。ドキュメントや画像をキャプチャするには、ファイルを選択し、保存画像を選択して、希望するフォーマットでビフォー・アフター画像を保存します。目的のセルを集めた後は、アンロードをクリックしてコレクターをステージから取り外します。

キャップ内に10マイクロリットルのプロテアーゼK消化緩衝液が残っているか確認し、必要に応じて補充してください。チューブを閉じて、しっかりとボルテックスしてください。その後、遠心分離機でチューブを短く回します。

RNA抽出まで、チューブはマイナス80度で保管してください。ペンスライドのヘマトキシリン染色された肝臓切片は、レーザーキャプチャーマイクロ解剖の前後に顕微鏡で観察されました。微小小胞ステアトーシスを示す関心領域は、A PCRチューブのキャップに正確に収集されました。

細胞形態を保つこと。約1000および2000のレーザー捕獲マイクロ解剖細胞から抽出されたリボ核酸は、それぞれ110.7ナノグラムと213.3ナノグラムを得ました。すべてのサンプルは1.9から2.1の吸収率で260×280ナノメートルの高純度を示しました。

ゲル電気泳動により、リボソームリボ酸の28sおよび18sの異なる核酸帯が明らかになりました。バイオアナライザーは、わずか1000個の細胞からリボ核酸のプロファイルを測定します。リボ核酸の完全性数値は6.7でした。

ハウスキーピング遺伝子ベータアクチンのQ-R-T-P-C-Rは、サイクル閾値が17から19の範囲を得ました。バイオアナライザーによる全リボ核酸50ナノグラムから構成されたシーケンスライブラリーの評価では、特徴的なピークが300塩基対から500塩基対の間で見られました。これらのライブラリのRNAシーケンスにより、Q20およびQ30のスコアで90%を超える高品質なデータが得られ、複製間で誤り率も低かった。

重要な考慮点は、防腐処理の停止、急速な染色、そして加工過程での直線的な状態を防ぐことです。この手順を順序付けすると、リアルタイムPCRや断片最適化ライブラリキーを用いたシーケンスに利用できます。肝臓サンプルで確立された。

このプロトコルは肝細胞サブグループのプロファイリングを可能にし、病理学に焦点を当てた肝臓学研究を支援します。