パラホルマルデヒド固定マウス肝組織のレーザーキャプチャ顕微解剖によるRNA解析
April 17th, 2026
本プロトコルは、パラホルムアルデヒド固定および最適切断温度化合物埋め込みマウス肝組織の定義された組織領域からRNAをレーザーキャプチャマイクロ解剖を用いて単離し、ターゲットを絞った下流遺伝子発現解析を可能にする方法を説明しています。
私たちの研究は主に慢性肝疾患の文脈における肝細胞関連の病態生理を調査しています。このプロトコルにより、肝組織の細胞分離やRNA抽出が可能になります。FFPE(パラホルマルデヒド固定法やCTプロトコルの保存・反復処理)とは異なり、正確なマイクロ解析と高品質なサンプルの取得が可能で、下流のOMI分析が可能となります。
ペンメンブレンスライドを紫外線に曝露するには4分30分後に行きます。スライドに0.1ミリグラム/ミリリットルのポリLリジンを塗り、自然乾燥させます。各スライドの端をニュートラルな取り付け媒体で密封してください。
RNase除染剤を使い、クライオスタットのアクセス可能な表面とすべての工具を拭き取ります。75%エタノールを使っています。ブラシと工具をしっかり掃除してください。
次に、クライオスタットの温度をマイナス20度に設定し、安定させる。マイナス80度の貯蔵から肝臓サンプルを回収しろ。サンプルを少なくとも15分間クライオスタットチャンバーに入れて平衡させます。
試料ステージに厚さ2〜3ミリのOCT化合物を塗布します。その後、試料ステージをクイックフリーシェルフやクライオスタットチャンバー内に置き、化合物層を事前に固化させます。少量のOCT化合物を事前に固化した層に塗布した後、平衡化された組織ブロックを水平にその化合物の上に置き、10秒から15秒間そのまま保持します。
次に、組織ブロックを取り付けた試料ステージをクライオスタットの標本ヘッドに取り付けます。次に、ブレードをクランププレートと背面プレートの片側から慎重に挿入します。クランプレバーをクランプして刃を固定します。
クライオスタットの厚さ設定を10マイクロメートルに調整してください。組織を切片に切り、マイナス20度の温度で保温した冷凍保存室内の事前処理ペンメンブレンスライドに直接取り付けます。スライドを室温で20分間解凍します。
スライドはRN ACEフリーPBSで3回洗い、各洗い4回10秒ずつ行います。組織切片にフィルターしたマイヤーヘマトキシリン溶液を5秒から10秒間加えます。その後、リボヌクレアーゼフリーの水でスライドを3回洗い、各洗いごとに10秒間洗い、残留したヘマトキシリンを除去します。
顕微鏡で染色の質を評価してください。吸水性の紙を使ってスライドを吸い取り、完全に自然乾燥させます。実験台の表面をRNase除染剤で拭き取る。
コントローラーをオンにして顕微鏡の初期化を完了させます。キーをオフ位置からオン位置に時計回りに回転させてレーザーシステムを起動します。コンピューターを起動し、レーザー捕捉マイクロ解剖ソフトを起動します。
その後、初期化が完了するまで待ちます。次に、無菌の0.2ミリリットルPCRチューブを採取装置に挿入します。ピペットを使って、PCRチューブのキャップにプロテアーゼK消化バッファー10マイクロリットルを加えます。
採取装置を顕微鏡標本ホルダーに装填してください。チェンジコレクターデバイスウィンドウで。基準点を調整し、カメラのフォーカスを調整して基準点をはっきり見られ、必要なら矢印で中央に合わせます。
組織を下向きにして、標本ホルダーに組織の断片を装填します。10倍対物レンズを選択し、特定の病理的特徴を持つ関心領域を特定します。レーザーメニューに進みます。
キャリブレーションをクリックし、はいを選択してキャリブレーションを完了します。レーザー制御パネルでレーザー出力を50、絞りを5、速度を9に設定してください。次にグラフィックツールバーを使ってターゲットエリアの周りに円を描きます。
単一の形状を選択し、スタートカットを押してレーザー捕捉マイクロ解剖を行い、採集装置を配置して解剖組織を採取します。ドキュメントや画像をキャプチャするには、ファイルを選択し、保存画像を選択して、希望するフォーマットでビフォー・アフター画像を保存します。目的のセルを集めた後は、アンロードをクリックしてコレクターをステージから取り外します。
キャップ内に10マイクロリットルのプロテアーゼK消化緩衝液が残っているか確認し、必要に応じて補充してください。チューブを閉じて、しっかりとボルテックスしてください。その後、遠心分離機でチューブを短く回します。
RNA抽出まで、チューブはマイナス80度で保管してください。ペンスライドのヘマトキシリン染色された肝臓切片は、レーザーキャプチャーマイクロ解剖の前後に顕微鏡で観察されました。微小小胞ステアトーシスを示す関心領域は、A PCRチューブのキャップに正確に収集されました。
細胞形態を保つこと。約1000および2000のレーザー捕獲マイクロ解剖細胞から抽出されたリボ核酸は、それぞれ110.7ナノグラムと213.3ナノグラムを得ました。すべてのサンプルは1.9から2.1の吸収率で260×280ナノメートルの高純度を示しました。
ゲル電気泳動により、リボソームリボ酸の28sおよび18sの異なる核酸帯が明らかになりました。バイオアナライザーは、わずか1000個の細胞からリボ核酸のプロファイルを測定します。リボ核酸の完全性数値は6.7でした。
ハウスキーピング遺伝子ベータアクチンのQ-R-T-P-C-Rは、サイクル閾値が17から19の範囲を得ました。バイオアナライザーによる全リボ核酸50ナノグラムから構成されたシーケンスライブラリーの評価では、特徴的なピークが300塩基対から500塩基対の間で見られました。これらのライブラリのRNAシーケンスにより、Q20およびQ30のスコアで90%を超える高品質なデータが得られ、複製間で誤り率も低かった。
重要な考慮点は、防腐処理の停止、急速な染色、そして加工過程での直線的な状態を防ぐことです。この手順を順序付けすると、リアルタイムPCRや断片最適化ライブラリキーを用いたシーケンスに利用できます。肝臓サンプルで確立された。
このプロトコルは肝細胞サブグループのプロファイリングを可能にし、病理学に焦点を当てた肝臓学研究を支援します。
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Overview
This article presents a detailed protocol for laser capture microdissection (LCM) and RNA extraction from paraformaldehyde (PFA)-fixed, OCT-embedded mouse liver sections. The method enables the isolation of specific histological regions for downstream transcriptomic analyses, ensuring high RNA purity and integrity suitable for sensitive applications such as qPCR and RNA sequencing.
Key Study Components
Area of Science
- Hepatology
- Molecular Biology
- Histology
Background
- Chronic liver diseases often require spatially resolved molecular analysis of hepatocyte subpopulations.
- Traditional FFPE methods can compromise RNA integrity, limiting downstream applications.
- LCM allows precise isolation of defined cell populations from complex tissues.
- PFA fixation and OCT embedding preserve tissue morphology and RNA quality for transcriptomic studies.
Purpose of Study
- To establish a robust protocol for isolating specific liver cell populations using LCM from PFA-fixed, OCT-embedded tissue.
- To extract high-quality RNA suitable for transcriptomic analysis from microscale samples.
- To validate the protocol's effectiveness for downstream applications such as qPCR and RNA sequencing.
Methods Used
- Preparation of pen membrane slides with UV exposure and poly-L-lysine coating.
- Cryosectioning of PFA-fixed, OCT-embedded mouse liver at -20°C.
- Hematoxylin staining and RNase-free handling throughout the workflow.
- Laser capture microdissection of histologically defined regions (approx. 1,000 cells).
- RNA extraction, quantification, and quality assessment (A260/A280 ratio, RIN, gel electrophoresis).
- Downstream validation by qPCR for β-actin and RNA sequencing with fragmentation-optimized library preparation.
Main Results
- RNA yields from 1,000–2,000 cells ranged from 110.7 to 213.3 ng.
- RNA purity was high (A260/A280: 1.9–2.1).
- RNA integrity number (RIN) averaged 6.7 ± 0.9, consistent with PFA fixation.
- qPCR for β-actin showed Ct values of 17–19, indicating good RNA quality.
- RNA-seq libraries showed characteristic peaks (300–500 bp) and >90% of bases at Q20/Q30 quality thresholds.
Conclusions
- This protocol enables precise, spatially resolved gene expression analysis in liver tissue.
- RNA extracted is of sufficient purity and integrity for sensitive downstream applications.
- The method supports hepatocyte subgroup profiling and pathology-focused hepatology research.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection (LCM) of paraformaldehyde-fixed, OCT-embedded mouse liver tissue enables spatially resolved transcriptomic profiling of defined cell populations, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides high-purity RNA suitable for sensitive downstream analyses, facilitating confident target validation and disease-relevant pathway interrogation. The protocol addresses a critical inflection point for hepatology and pathology-focused R&D portfolios seeking robust, region-specific molecular insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially precise interrogation of hepatocyte subgroups within complex liver tissue.
- Supports functional target validation by isolating histologically defined regions for RNA analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular signatures to specific pathological features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by providing high-quality, region-specific RNA data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream qPCR and RNA sequencing workflows.
- Ensures assay reproducibility through standardized tissue processing and RNA quality metrics.
- Delivers quantitative outputs (e.g., Ct values, RNA integrity) for reliable compound evaluation.
- Enables platform reuse for multiple transcriptomic applications in liver disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant histopathology for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting sensitive RNA-based analyses.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by ensuring sample integrity and data quality.
- Supports pathology-driven research in chronic liver disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This LCM protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling targeted gene expression analysis from fixed tissue sections, bridging histological assessment and molecular readouts.
- Discovery Biology: Provides spatially resolved hypothesis testing and pathway clarification in liver tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for assay development and validation.
- Analytics: Supplies high-purity RNA and robust quality metrics (A260/A280, RIN, Ct values) for comparative analyses.
- Translational Research: Connects histopathological features to transcriptomic profiles for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for spatial transcriptomics in fixed tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning, histological staining, and LCM instrumentation.
- Demands access to RNase-free facilities and analytical infrastructure for RNA quality assessment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and RNA extraction protocols.
- May require adaptation for other tissue types or disease models with validation.
- RNA integrity is inherently limited by PFA fixation but remains suitable for qPCR and RNA-seq.
