マウス角膜からの単細胞懸濁液採取プロトコル
2026年4月3日
ここでは、コラーゲンAとトリプシンを用いた逐次消化を通じて、マウス全角膜から高品質な単細胞懸濁液を得るプロトコルを紹介します。この方法は高いRNA完全性を持つ生存可能な単一細胞を生成し、単一細胞RNAシーケンシングやフローサイトメトリyなどの後続応用にも適合します。
このプロトコルは主に、完全なマウス角膜から高品質な単一細胞を得る方法を導入します。当社の方法は、高いRNA完全性を持つ実用的な単一細胞であり、厚薄および流量径の単一細胞など、後続の応用に適しています。まず、生後6〜8週間の安楽死済みメスのC57BL6マウスを無菌解剖台に置きます。
閉じたまぶたをPBSで洗い流した後、眼科ハサミで眼球の後方の極に切開をし、冷たい補佐ホルモン上皮培地を切開したペトリ皿に慎重に置きます。1XPBSと5%ペニシリンストレプトマイシンを補足して眼球を3回洗い流した後、眼底のハサミと鉗子を使って後部から角膜縁部にかけて切開を行います。角膜を強膜から強膜と結膜から縁縁に沿って優しく切り離し、2対の鉗子を使って水晶体と虹彩を完全に取り除きます。
角膜組織をPBSで3回洗った後、きれいな組織を新しいチューブに移します。コラーゲンA溶液を1ミリリットルあたり5ミリグラムを加え、組織を約0.5×0.5ミリメートルの断片に眼用ハサミで刻みます。角膜断片を含むチューブをコラーゲンA溶液とともに、37度摂氏の細胞培養インキュベーターで1時間培養します。
消化中は10分ごとに組織を点検してください。大きな組織断片が残らなくなったら、300Gで室温で5分間遠心分離し、その後慎重に上清液を吸引します。次に、ペレットを0.25%トリプシンEDTA溶液200マイクロリットルに再懸浮させます。
チューブを37度Cに設定された細胞培養インキュベーターに10分間置き、残った組織断片を消化します。最後に、幅広の先端を備えたP1000ピペットを使い、混合物を優しく乾燥させて単細胞懸液を得る。先に示したように細胞懸濁液を遠心分離し、細胞ペレットを0.04%BSAを含むPBSで再懸濁します。
ヘモサイトメーターを用いて単離された角膜細胞を数えたところ、8個の角膜から合計1.05×10の5の乗が得られ、平均細胞生存率は94.6%、単細胞比は96.3%を超え、懸浮作用の適合性が確認されました。免疫蛍光解析の結果、細胞懸濁液は83.5%の汎-CK陽性上皮細胞、13.5%の角化細胞陽性間質細胞、および約3%の細胞が陰性で両マーカーを含んでいました。単一細胞懸濁液から抽出されたRNAは、約8.8と高いRNA完全数を示し、リボソームRNA比は約2.15で28S×18Sであり、優れたRNA品質を裏付けました。
単一細胞を得た後、角膜細胞の機能や表面マークの探索を特徴付けることができます。この分野は細胞間相互作用の研究です。この方法の課題は、角膜を他の組織からほぼ分離することです。
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概要
本記事では、マウスの角膜全層から高品質な単一細胞懸濁液を単離するための堅牢なプロトコルを紹介します。この手法は、精密な組織切除と連続的な酵素消化を組み合わせることで、単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）やフローサイトメトリーなどのダウンストリームアプリケーションに適した、生存率の高い単一細胞の調製を可能にします。本プロトコルにより、高い細胞回収数と優れた生存率が得られ、RNAの完全性も維持されるため、角膜の細胞異質性の詳細な解析が容易になります。
研究の主要構成要素
科学分野
- 眼科学
- 細胞生物学
- シングルセル解析
背景
- 角膜は眼の最外層であり、視覚および眼表面の恒常性維持に不可欠です。
- 単一細胞RNAシーケンシング（scRNA-seq）には、高品質な単一細胞懸濁液が必要です。
- 角膜組織は密度が高く複雑であるため、細胞の分散が困難です。
- 既存のプロトコルでは、細胞生存率が低いか、あるいはRNAの品質が不十分な場合が多く見られます。
研究目的
- 無傷のマウス角膜から単一細胞懸濁液を作製するための信頼性の高いプロトコルを確立すること。
- ダウンストリームアプリケーションに向けて、高い細胞生存率とRNAの完全性を確保すること。
- 主要な角膜細胞種の正確な同定および定量化を可能にすること。
使用した手法
- 安楽死させたC57BL6マウスからの角膜の摘出。
- コラゲナーゼAおよびtrypsin-EDTAを用いた連続的な酵素消化。
- 機械的な細断および緩やかなトリチュレーションによる単一細胞懸濁液の調製。
- トリパンブルー染色および血球計数器を用いた細胞生存率の評価。
- Pancytokeratin（上皮細胞）およびKeratocan（実質細胞）に対する免疫蛍光染色。
- バイオアナライザーを用いたRNA整合性解析。
主な結果
- 8個の角膜から約 1.05 × 105 個の細胞を回収した。
- 高い細胞生存率（94.6%）および単一細胞率（96.3%）を確認した。
- 細胞組成：pan-CK陽性の上皮細胞 83.5%、keratocan陽性の実質細胞 13.5%、両方のマーカーに陰性の細胞 約3%。
- RNA整合性番号（RIN）は約 8.8、28S/18S rRNA 比は約 2.15であり、極めて良好なRNA品質を示した。
結論
- 本プロトコルにより、マウス角膜から高品質な単一細胞懸濁液を安定して調製できます。
- 調製された細胞は、scRNA-seqを含む高度なダウンストリームアプリケーションに適しています。
- 本手法は、角膜細胞の機能や細胞間相互作用の詳細な研究を促進します。
よくある質問
産業上の重要性
マウス角膜からの高品質な単一細胞懸濁液の調製は、探索段階の眼科研究を推進し、高解像度の細胞プロファイリングを実現するために不可欠です。本プロトコルでは、密度の高い眼組織から生存しておりRNAが保持された単一細胞を調製するという重要なボトルネックを解消し、これにより下流の単一細胞解析の信頼性に直接的に寄与します。堅牢な細胞調製は、ターゲット検証における予測の信頼性を高め、探索段階から前臨床パイプラインに至るトランスレーショナルな連続性をサポートします。
バイオ医薬品R&Dにおける戦略的応用
初期発見およびターゲット検証
- 単一細胞解像度での角膜細胞の不均一性の解析を可能にします。
- 細胞生存率とRNAの完全性を維持することで、機能的なターゲット検証をサポートします。
- 正確な細胞型の同定により、メカニズム的なリスク低減を促進します。
- 初期段階の眼科的ターゲット選択における予測の信頼性を向上させます。
スクリーニングおよびアッセイ開発
- アッセイ開発に向けた、標準化された生存率の高い単一細胞懸濁液を提供します。
- ダウンストリームの単一細胞RNAシーケンシングにおける再現性と定量的な出力を保証します。
- スケール可能なスクリーニングワークフローに向けた、検証済みの生物学的材料を調製します。
- 異なる角膜細胞集団に対する化合物の影響を、信頼性高く評価することを可能にします。
トランスレーショナル・前臨床研究
- 固有の角膜細胞の多様性を維持することで、疾患関連モデルとの整合性を図ります。
- RNAの品質を維持し、翻訳バイオマーカーの探索および検証を可能にします。
- 探索段階から前臨床段階までのデータの連続性を確保し、リスクを調整した開発推進の意思決定をサポートします。
- 前臨床眼科研究における生物学的な曖昧さを低減します。
パイプラインおよびワークフローの統合
本プロトコルは、初期探索と前臨床研究の接点を統合し、組織解離から単一細胞解析、およびそれに続く機能研究へのスムーズな移行を可能にします。
- 探索生物学：高忠実度のシングルセルプロファイリングを可能にすることで、仮説検証およびパスウェイの解明をサポートします。
- スクリーニング：アッセイへの適用および化合物スクリーニングに適した、再現性のある定量的なシングルセル懸濁液を提供します。
- アナリティクス：比較分析のための、強固な細胞生存率、細胞型の定量化、およびRNA整合性指標を提供します。
- トランスレーショナルリサーチ：バイオマーカーの整合および前臨床検証のために、細胞の多様性とRNA品質を維持します。
- エンタープライズ再利用：眼科研究プログラム全体で適応可能な標準化プロトコルを確立します。
運用および企業への影響
- 科学的価値：ターゲットバリデーションにおける予測の信頼性を高め、メカニズム的な曖昧さを軽減します。
- 運用的価値：標準化され、再現性があり、スケーラブルな単一細胞調製を実現します。
- 戦略的価値：根拠に基づいたgo/no-go判断を可能にし、眼科領域の研究開発における資本効率を向上させます。
- ポートフォリオへの影響：リスク調整後の優先順位付けと、創薬段階にあるアセットの推進を支援します。
実施上の検討事項
- 眼組織の解剖および酵素消化技術に関する専門知識が必要です。
- 細胞生存率アッセイ、免疫蛍光染色、およびRNA整合性解析装置へのアクセスが必要です。
- 再現性とデータの比較可能性を確保するため、チーム間での標準化が求められます。
- プロトコルの最適化により、他の緻密な組織タイプにも適用可能です。
- コンタミネーションを回避しサンプルの純度を確保するためには、組織分離における精度が極めて重要です。
