中和抗体価測定のための肝炎Eウイルス蛍光減少中和検査

蛍光減少に基づく中和試験の主な目的は、ワクチン候補およびHEVに対する抗体の中和可能性を定量化することです。HEVは既知の細胞病理的性質があるため、PRNDアッセイは制限されます。このプロトコルは、免疫ベースのPRNDトレーニングに焦点を当てており、感染した細胞を可視化し、その後マイムを観察します。まず、新たに分裂したHuH-7細胞を数えます。

次に、顕微鏡用ガラスカバースリップを12ウェルプレートに置き、1ミリリットルの完全なDMEMに10%FBSを補足して、1ウェルあたり20万個の細胞をシードします。細胞を37度の温度で5%の二酸化炭素で一晩培養します。翌日、精製されたg1-HEVのゲノムコピー4のべき乗に分ける血清フリー培地500マイクロリットルをシード細胞に加えます。

37度で5%二酸化炭素を含んで1時間培養します。500マイクロリットルのDPBSを使ってセルを3回洗浄します。2ミリリットルのDMEMに加え、2%FBSを補足します。

細胞を37度の温度で5%二酸化炭素とともに72時間培養します。細胞を500マイクロリットルのDPBSで3回洗い、それぞれの洗浄の間は室温で5分間培養します。細胞に4%パラホルマルデヒド500マイクロリットルを加え、室温で20分間培養します。

その後、先に示したようにDPBSで細胞を洗浄します。最終洗浄後、室温で30分間DPBSで培養します。DPBSに5%の通常のヤギ血清、0.5%の牛血清アルブミン、0.3%のTriton X100を含むブロッキング溶液250マイクロリットルを加えます。

シェイカーで室温で1時間孵化します。ブロッキング液を取り除き、500マイクロリットルのDPBSで一度洗います。次に、1対500の希釈で250マイクロリットルの一次抗体溶液を加えます。

細胞を4度で一晩培養します。翌日、先ほど示したようにDPBSで細胞を3回洗浄します。二次抗体100マイクロリットルを1対1,000希釈で加え、室温の腐植容器で1時間培養します。

前述の洗浄インキュベートサイクルを実施してください。10マイクロリットルのDAPI入りアンチフェード試薬をガラススライドに加えます。カバースリップは、気泡を避けつつ試薬に向かってセルを取り付けます。

カバースリップをネイルポリッシュで密封し、共焦点顕微鏡観察のために保存してください。新たに分裂したHuH-7細胞を数えてください。次に、顕微鏡用グレードのガラスカバースリップを12ウェルプレートに置き、1ミリリットルの完全なDMEMに20万個の細胞をシーディングします。

翌日、血清フリー培地で抗ORF2抗体およびウサギ免疫グロブリンG抗体を10倍の連続希釈液を準備し、初期抗体濃度は25マイクログラム/ミリリットル、最終希釈は最大10マイクログラム/ミリリットルのマイナス5乗まで希釈します。希釈の最終体積は100マイクロリットルであるべきです。次に、各抗体希釈に1.8×10を4コピーの精製g1-HEVゲノムコピーのべき乗に加えます。

抗体ウイルス混合物を37度Cで5%二酸化炭素とともに1時間培養します。細胞を500マイクロリットルのDPBSで洗浄します。抗体ウイルスの混合物を細胞に加えます。

37度で5%二酸化炭素を含んで1時間培養します。細胞を500マイクロリットルのバッファーで洗浄します。2%FBSを含むDMEMを加えた後、37度で5%二酸化炭素を含んで72時間培養します。

前述のように細胞を免疫蛍光染色のために処理します。蛍光画像を取得した後、ImageJソフトウェアを開きます。「ファイル」を選択し、画像を開きます。

次に「画像」「タイプ」を選び、「8ビット」をクリックしてRGB画像を8ビット形式に変換します。画像を選択し調整し、次にしきい値を設定し、下位レベルを40、上限レベルを255に設定してしきい値を調整します。「分析」を選択し、「粒子分析」を選択し、「結果表示」「結果をクリア」「要約」「エッジの除外」「興味のある複合領域」を有効にします。

その後、OKをクリックして蛍光スポットカウントを取得します。提供された式を用いて、Log10 NT50のアンチログとして中和率とNT50を計算します。すべての場の平均と標準偏差を示すグラフをプロットします。

感染細胞では、モック感染細胞と比較してg1-HEVリボ核酸の有意なレベルが検出されました。抗ORF2抗体を用いた免疫蛍光アッセイにより、感染したHuH-7細胞におけるORF2発現が確認されました。抗ORF2抗体の50%中和抗体価は2.1×10の3乗と推定されました。

代表的な画像は、蛍光還元中和試験で模感染およびg1-HEV感染したHuH-7細胞の出現を示しています。このプロトコルにより、研究者は抗HEV抗体の中和能力を調査し、その50%中和抗体価を測定できます。このプロトコルの重要なステップは、感染性E型肝炎ウイルスの分離と適切な細胞染色および高解像度画像の取得です。

RT-qPCRやELISAなどの代替手法を用いて中和タイターを決定することもできますが、いくつかの制限があります。