Name: 小型化Montal–Mueller平面脂質二重層システムを用いた、合成K2Pチャネル記録のためのシングルチャネル電気生理学 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-10-09T13:05:00.000+00:00
Duration: 7 min 58 s
Description: 学ぶ小型化Montal–Mueller平面脂質二重層システムを用いた合成K₂Pチャネルのシングルチャネル電気生理学。ancTREK1の再構成と記録により、試薬消費を削減し、単一分子レベルでのイオンチャネル機能解析を実現する革新的なプラットフォームです。

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細胞トランスフェクション手順にご協力いただいたSofia Diletta Guzzeloni氏に感謝いたします。また、Elements社のDr. Leon Juarez氏とDr. Michelangelo Paci氏に深く感謝申し上げます。本研究は、イタリアのパヴィア大学分子医学科のDipartimenti di Eccellenza (2023–2027) イニシアチブ、Cariplo財団（#2019-1809）、およびM.L.へのPNRR研究プログラムCN00000013「National Centre for HPC, Big Data and Quantum Computing」による支援を受けて行われました。

F.T.はElements S.r.l.のCEOであり、A.P.はその従業員です。その他の著者は、競合する利益がないことを宣言します。

本研究では、PLB法を用いて合成K2Pチャネルの電気生理学的特性を単一分子レベルで評価しました。科学文献に記載されている様々な平面脂質モデルの中で、我々はBLMの形成に着目しました。BLMは、2つの水相区画を隔てる垂直な非極性表面に開けられた直径50から140 µmの開口部の上に形成されます。この構成により、脂質膜の調製や電解質組成（例：イオン強度やpH）などの実験パラメータを制御しつつ、細胞膜環境をシミュレートすることが可能です3。我々はMontal–Mueller（フォールディング）法5を用いてBLMを再現しました。この手法では、2つの水溶液の気液界面に事前に展開された2つの脂質単分子層が、水位を上げることで開口部で結合し、膜が自発的に構築されます。
ここで提示する膜形成のプロトコルは非常に直感的ですが、実験の成功に強く影響するいくつかの重要なステップがあります。BLMchipMMとアンプの間の適切な電気的接続を確保するためには、PCBソケットに挿入されるAg/AgCl電極線の端部が塩素化されるのを避けることが不可欠です。BLMchipMMの組み立て時に電線の配置が不適切であると、アンプのケースに接触し、短絡や信号の飽和を招く可能性があります。アパーチャの前処理手順ももう一つの重要な要因です。前処理溶液の塗布時に過度な力を加えると、ポリイミドセプタムを損傷させる可能性があり、また電解質溶液の取り扱いが不適切で、特にアパーチャ領域を浸しすぎると、膜形成が妨げられることがあります。さらに、再現性を確保するためには、BLMchipMM記録チャンバーを丁寧に洗浄することが不可欠です。100% isopropyl alcoholを使用し、その後に十分にすすいで完全に乾燥させることで、残留物が以降の実験に干渉しないようにします。
本プロトコルには、いくつかの変更が可能です。漂白剤への浸漬による塩素化は実用的で広く用いられている手法ですが、電気メッキなどの代替法も採用できます43。同様に、前処理および脂質調製法においても変更が可能です。標準的な前処理溶液は、通常、揮発性炭化水素溶媒に溶解した長鎖アルカンで構成されます36。一般的にn-hexane中の1%ヘキサデカン溶液が使用されますが、他の溶媒が適している場合もあります。また、実験上の要求に応じて、脂質組成を調整することも可能です。DPhPC脂質は最適な膜安定性を提供しますが、天然または合成組成を含む代替脂質混合物を使用することもできます36。フォールディング法によって形成される垂直脂質二重層の主な利点は、各リーフレットが異なる脂質種で構成される非対称膜を生成できることであり5,22、この特徴は膜タンパク質の機能に影響を与えることが知られています。
膜形成のトラブルシューティングでは、一般的に水相の液量調整を行います。最初に膜が形成されない場合は、一方のコンパートメントのバッファー液量を繰り返し下げて上げることで、二層膜の構築を促進できます。それでも成功しない場合は、アパーチャーの上に気泡を導入することで、脂質の再分布と膜形成を促進させることができます。それでも解決しない場合は、通常、前処理や汚染に関連する問題が考えられるため、記録室を洗浄し、実験を最初からやり直すことを推奨します。
このセットアップの主要構成要素は、eNPR 100 kHzコンパクトアンプとBLMchipMMで構成されています。このアンプは小型で低ノイズのボルテージクランプシステムであり、アンプの筐体自体が効果的な電磁シールドを提供するため、外部のファラデーケージを含む追加の外部装置を必要としません。BLMchipMMは、アンプに直接接続するためのPCBが統合された、組み立て済みの小型記録チャンバーです。これは、テーパー状にレーザー穿孔された開口部を持つポリイミドセプタムによって隔てられた2つのC字型コンパートメントで構成されており、この開口部で人工膜が形成されます。コンパートメント容積が約110 µLというシステムの小型化により、試薬の消費量が大幅に抑えられ、固有容量が減少するため、信号品質が向上します。さらに、適切な洗浄手順に従えば、分解することなくデバイスを何度も再利用できるため、ばらつきが抑えられ、実験の再現性が高まります。
これらの利点がある一方で、いくつかの制限事項を考慮する必要があります。現在のセットアップには、温度、圧力、または灌流制御のための統合モジュールが含まれていません。固有の膜張力は、TREK144,45,46などのメカノセンシティブチャネルに影響を与えることが報告されていますが、本セットアップには膜張力の制御的な操作は含まれておらず、本研究でメカニズム的な結論は導き出していません。全体として、このプラットフォームは、人工膜におけるイオンチャネル活性を記録するための堅牢でアクセスしやすいシステムを提供します。本研究では、TREKサブファミリーの計算科学的に導出された祖先チャネルである合成K2PチャネルancTREK1を調査しました。記録されたデータは、PLBに再構成された精製ancTREK1が、報告されているTREK1様コンダクタンス特性と一致する単一チャネル挙動を示すことを実証しています。Mg2+フリーの対称200 mMカリウム条件下において、本チャネルは測定可能なI–V関係を示し、振幅値は80 mVで約13 pA、−80 mVで−19 pAとなりました。さらに、ancTREK1はTREK1チャネルで観察される特徴的な大コンダクタンスモードを示し、正電位（~112.8 pS）と比較して負電位（~205.6 pS）で高いコンダクタンスを示しました。特筆すべき点として、ancTREK1は正電位でNPoが増加し（80 mVで0.78）、負電位でNPoが減少（−80 mVで0.53、−120 mVで0.28）しており、これは切り出しパッチ構成での観察結果42とは異なります。これらの知見は、再構成膜タンパク質の原理実証的な単一チャネル記録における本システムの有用性を支持するものです。

ブラックリピッドメンブレン（BLM）としても知られる人工脂質二重層膜へのイオンチャネルの再構成は、単一分子レベルでイオンチャネルの電気生理学的特性評価を行うための確立された手法の一つです1。BLMの利点はその構造にあります。実際に、非極性表面の孔内に平面脂質二重層（PLB）が形成され、2つの液体溶液が隔てられます。このように生物学的膜を模倣することで、膜の脂質組成や電解質または化学化合物の濃度を含む高度に制御された条件下で、かつ両側からアクセス可能な状態でイオンチャネル活性の記録が可能になります。このアクセス容易性により、例えばミセル溶液からの直接挿入や、リポソーム駆動融合によるイオンチャネルの導入も可能になります2,3。
最初に報告された人工膜システムはペインティング法4を用いて構築されたもので、不揮発性有機溶媒に溶解した脂質ドロップレットを、絵筆を用いて小さな開口部に塗布する手法である。その後、開口部の両側に水溶液を加えることで、脂質二重層が自発的に形成される。しかし、この方法の大きな欠点は溶媒の痕跡が残ることであり、それが膜の特性に影響を及ぼす可能性がある。脂質二重層内の残留有機溶媒量を減らすために、フォールディング法5が開発され、「溶媒フリー」のBLMの形成が可能となった。このアプローチでは、揮発性溶媒中の脂質溶液を水面に広げて2つの単分子層を形成させ、開口部上の水相の液面を徐々に上昇させることで、これらの脂質単分子層が開口部をまたいで折り畳まれ、二重層が形成される。しかし、得られたBLMは溶媒フリーと定義されているものの、二重層形成を成功させるには、開口部を不揮発性溶媒の薄い層で前処理する必要がある。これらの実験に必要な核心的要素は、小さな開口部（直径50–250 µm）を持つ親油性セプタムで仕切られた2つの水相コンパートメント（通常、cisおよびtransと呼ばれる）を備えた記録室である（Figure 1）。各コンパートメントには銀/塩化銀 (Ag/AgCl) 電極が挿入される。これらの電極を電解質溶液に浸すと、脂質二重層と記録装置との間に電気化学的な接続が確立される。記録装置はボルテージクランプアンプで構成されており、これにより膜電位の精密な制御と、埋め込まれたポア形成タンパク質を通過するイオン電流の同時測定が可能となる。
<img alt="脂質二重層イオンチャネルの図；電気生理学セットアップ；チャネルの閉鎖/開放状態の解析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig1.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="図 1"> 
図 1: 平面脂質二重層（PLB）電気生理学セットアップの概略図。 PLB実験に必要な基本構成要素の概略図。記録チャンバーは、脂質二重層が形成される開口部を持つ親油性セプタムによって隔てられた2つの水溶液区画（cis側およびtrans側）で構成される。各区画の電解質溶液には銀/塩化銀（Ag/AgCl）電極が浸漬されている。一方の電極で電圧刺激（例：正弦波、方形波、または三角波）を印加し、接地されたもう一方の電極は、イオン電流を比例した電圧信号に変換する電流-電圧変換器に接続される。この信号は増幅され、必要に応じてフィルタリングされた後、デジタル化され、リアルタイムのモニタリングおよび解析のために記録される。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig1large.jpg" target="_blank">こちらのリンクをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
BLMを形成するための他の手法も確立されています。その中でも一般的なアプローチは、パッチクランプピペットの先端に懸垂させた脂質二重層を作成する方法です。それに伴い、チップディップ法6では、空気-水界面にある脂質単分子層にピペット先端を繰り返し浸漬させることで、通過するたびに単一のリーフレットを取り込み、直径約4 µmのガラスマイクロピペットの開口部に溶媒フリーの懸垂脂質二重層を形成させることができます。また、パッチクランプ技術は、脂質二重層におけるシングルチャネル測定にも用いられてきました。例えば、パンチアウト法7では、直径10から80 µmのガラスピペットを使用して、記録室の開口部にあらかじめ塗布された大きな膜をパッチします。あるいは、リポソームパッチ法では、あらかじめ形成されたナノからマイクロサイズの小胞を溶媒フリーのBLMとして利用します8,9。特に、巨大単層小胞（GUV）は、セルアタッチ法や切除パッチ法などのさまざまなパッチクランプ構成によるシングルチャネル記録に広く利用されています10,11。
複数の二重層を並列かつ自動的に形成するためのプラットフォームもいくつか登場しています。その一つのアプローチが液滴界面二重層（DIB）法12であり、これは脂質-溶媒混合液中に水性液滴を配置する方法です。この手法では、液滴の周囲に脂質単分子層が自発的に形成され、2つの液滴が接触したときに二重層が形成されます。一部の構成では、膜の安定性を向上させるためにハイドロゲル上にDIBを形成させることができます13。ガラスピペットの先端でのDIB形成に基づいた別のアプローチに、接触気泡二重層（CBB）法14があり、ここでは2本のマイクロピペットを用いて油相中に水性気泡を導入します。DIBアプローチと同様に、脂質でコーティングされた2つの気泡を接触させると、脂質二重層が自発的に形成されます。もう一つのプラットフォームとしてアレイ化されたBLMシステムがあり、これは格子状に配置された明確なマイクロからナノスケールのポアアレイで構成されています。これらのシステムにおいて、懸垂脂質二重層は、ペインティング法やフォールディング法などの手動操作、あるいはリポソーム小胞の破裂15,16,17によって形成されるか、またはマイクロ流路構造と組み合わせることで、脂質溶液と緩衝液を順次注入することにより自動的に形成されます18,19。
溶媒を用いないBLMを形成するために多くの手法が開発されてきましたが、本研究では、人工脂質二層膜に組み込まれた膜タンパク質の単一チャネル挙動を調査するため、小型化および統合化されたプラットフォーム内で実装されたフォールディング法に焦点を当てます。実験は、Elements Nanopore Reader（eNPRアンプ）とBLMchipMMからなるElementsセットアップを用いて行われました（Figure 2A および Figure 2B）。前者はコンパクトで低ノイズな電位固定アンプであり、完全かつ独立したユニットを形成することでワークスペースを簡素化し、追加の外部デバイスの必要性を排除しています。BLMchipMMは、Montal–Mueller法用に設計された事前組み立て済みの小型システムであり、実験インターフェースとして機能します。これは、プリント回路基板（PCB）と統合された透明なポリメタクリル酸メチル（PMMA）記録チャンバーで構成されており、PCBにはアンプに直接接続するための電極として機能するAg/AgCl線を取り付けるための2つのソケットが含まれています。チャンバーの基本構造は、2つの透明なPMMAコンポーネントの間に封止されたポリイミドセプタムで構成されています。セプタムの厚さは50 µmですが、二層膜の形成を容易にするため、中央の小さな領域（3.78 mm2）のみ厚さが25 µmに減少しています。この薄い領域の中心には、レーザー drillingによってテーパー状のアパーチャが形成されており、これにより脂質二層膜の機械的安定性が向上します20,21。4つのアパーチャ径（50, 75, 100, および 140 µm）が利用可能であり、膜容量の調整が可能です（Table 1）。各PMMAコンポーネントには容量110 µLのC字型キャビティがあり、ポリイミドセプタムの両側に電解質溶液を保持するための2つの流体コンパートメントを形成しています。各PMMAブロックの反対側には2つの傾斜した流体チャネルが設けられており、一方のチャネルはAg/AgCl電極の挿入に使用され、もう一方はピペッティングによるリザーバー内のバッファー液量の手動調整に使用されます。
<img alt="モジュール式コンパートメントを備えたマイクロ流体デバイス。概略図はPMMA側、電極、および解析用PCBを示している。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="図2"> 
図2Integrated Elements Nanopore ReaderおよびBLMchipMMシステム。 (AElements Nanopore Reader (eNPR)アンプリファイアの専用スロットに挿入されたBLMchipMMを示す写真。BBLMchipMMの構成要素の概略図。ポリメタクリル酸メチル（PMMA）製記録チャンバー、マイクロサイズの開口部を有するポリイミドセプタム、およびAg/AgCl電極用ソケットとチャンバー調整用スロットを備えたプリント基板（PCB）を含む。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>穴径（µm)</td>
			<td>50</td>
			<td>75</td>
			<td>100</td>
			<td>140</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>孔厚（µm)</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
			<td>25</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>標準的な膜容量 (pF)</td>
			<td>20–40</td>
			<td>40–60</td>
			<td>60–90</td>
			<td>90–140</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
表1：利用可能なBLMchipMMアパーチャ形式の特性。50、75、100、および140 µmのアパーチャを持つBLMchipMMデバイスの孔径、アパーチャ領域のセプタム厚、および代表的な膜容量値。膜容量値は、1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine脂質から形成されたバイレイヤーについて示されている。
一般的に、研究室で使用される記録チャンバーは、自作のユニットか市販のデバイスのいずれかです。自作の場合、システムの構築にはさまざまなコンポーネントの組み立てや、セプタムにアパーチャを作成するための信頼性の高い手法の開発が必要であり、多くの研究室にとって導入のハードルとなることがあります。市販のデバイスを使用する場合でも、各実験の前に複数のコンポーネントを手動で統合する必要があることが多くあります。対照的に、BLMchipMMは事前に組み立てられており、日常的な洗浄手順のために実験間で分解する必要はありません。使用する溶媒がデバイスの材質と適合していれば、同じユニットを洗浄して複数の実験で再利用することができ、膜形成の品質を損なうことはありません。これにより、ユーザーによるばらつきが軽減され、手動のシーリング要素に伴う漏れのリスクを最小限に抑えることができます。また、外部に取り付け可能で交換および再生が可能な銀線電極を使用することで、特に電極の消耗が早まる実験条件下において、システムの有効寿命をさらに延ばすことができます。
さらに、自作のデバイスはコンパートメント容積が大きくなる傾向があり、実験に必要な生物学的および化学的成分の量が増加します。対照的に、BLMchipMMの小型化により、実験液量を最小限に抑えることができ、その結果、試薬、タンパク質、およびその他の化合物の消費量を大幅に削減することが可能です。これは、発現が困難な膜タンパク質や収率の低い膜タンパク質を扱う場合や、試験化合物の合成コストが高く、実験全体のコストが増大する場合に特に有利です。重要な点として、BLMchipMMは溶媒量を最小化した脂質二重層の形成を可能にし、各リーフレットを異なる脂質種で構成できる非対称膜構成をサポートしているため5,22、制御された条件下での膜タンパク質の機能研究を促進します。
従来、電流測定はパッチクランプ実験用に設計されたアンプを用いて行われてきました。これらのシステムは、データ収集のための別途のデジタイザーへの接続や、グラフィカルインターフェースによる制御が必要となることが多くあります。また、かさばり高価であるだけでなく、専門外のユーザーにとって設定手順が直感的でない場合が頻繁にあります。さらに、記録チャンバーのサイズや標準的なアンプの設計により、ヘッドステージ入力を静電干渉から保護する内蔵シールドが通常備わっていないため、外部ファラデーケージの使用が必要になることが多くあります。このようなケージの品質や接地状態は、システムのノイズ性能に大きく影響します。BLMchipMMを小型の統合アンプと共に使用することで、外部コンポーネントの必要性が低減し、この構成を簡素化できます。信号のデジタル化はデバイス内で行われ、システムハウジングがシールドとして機能するため、周囲の電磁干渉への感受性が低減します。
本プラットフォームの適用可能性を実証するため、計算的に導出されたTREKサブファミリーの祖先メンバーであるK2P様チャネルancTREK1（付録図1）をテストタンパク質として用い、再構成およびシングルチャネル記録の成功を検証した。K2Pチャネルは、静止膜電位と細胞の興奮性を調節する二量体カリウム漏出チャネルを形成し、その中でもTREKチャネルは十分に特性解析されたサブファミリーである。

<table><tbody><tr><td>1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン (DPhPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850356P</td><td>人工脂質二重層の形成</td></tr><tr><td>2-プロパノール（&amp;ge;99.5%)</td><td>Honeywell</td><td>24137-5L</td><td>BLMchipMMデバイスの洗浄</td></tr><tr><td>アガロース</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP160-500</td><td>アガロースゲルの調製</td></tr><tr><td>アガロースゲル水平電気泳動装置</td><td>BTLabSystems</td><td>BT102</td><td>DNA断片の分離</td></tr><tr><td>アンピシリン</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP1760-25</td><td>形質転換菌の選択</td></tr><tr><td>抗GFPナノボディSepharoseレジン（自家製）</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>GFPタグ付きタンパク質のアフィニティー精製</td></tr><tr><td>Anza アルカリホスファターゼ</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2208</td><td>ベクターの脱リン酸化</td></tr><tr><td>Anza EcoRI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0116</td><td>制限酵素消化</td></tr><tr><td>Anza NotI</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN0014</td><td>制限酵素消化</td></tr><tr><td>Anzaレッドバッファー (10&amp;times;)</td><td>Invitrogen</td><td>IVGN2008</td><td>制限酵素消化バッファー</td></tr><tr><td>アプロチニンプロテアーゼ阻害剤</td><td>Fisher Scientific</td><td>15996008</td><td>タンパク質分解の防止</td></tr><tr><td>卓上遠心機</td><td>Eppendorf</td><td>EP5420000164</td><td>細胞のペレット化およびサンプル調製</td></tr><tr><td>BLMchipMM</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>平面脂質二重層の形成</td></tr><tr><td>コレステリルヘミコハク酸 (CHS)</td><td>Anatrace</td><td>CH210</td><td>膜タンパク質の安定化</td></tr><tr><td>クマシーブリリアントブルー</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1125530025</td><td>タンパク質染色</td></tr><tr><td>一般的な家庭用漂白剤</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>Agワイヤの塩素化</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11284932001</td><td>ライセート粘性の低減</td></tr><tr><td>二回蒸留水</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>緩衝液および溶液の調製</td></tr><tr><td>エタノール（純度99.9%）</td><td>Girelli Alcool s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>Ag/AgCl電極線の洗浄</td></tr><tr><td>エチジウムブロマイド</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1116080030</td><td>DNA染色</td></tr><tr><td>極細目サンドペーパー</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>電線からのAg/AgClコーティングの除去</td></tr><tr><td>eNPR 100 kHz アンプ</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>電気生理学的記録</td></tr><tr><td>アガロースからのDNA抽出用Gel-Outキット</td><td>A&amp;amp;バイオテクノロジー</td><td>023-250</td><td>DNA精製</td></tr><tr><td>GeneRuler 1 kb DNAラダー</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM0311</td><td>DNAサイズリファレンス</td></tr><tr><td>フリースタイル&amp;trade; 293-F</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td>ancTREK1タンパク質の発現</td></tr><tr><td>HEPES (&amp;ge;99.5%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375-500G</td><td>緩衝剤</td></tr><tr><td>ヘキサデカン (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6703-100ML</td><td>開口部の前処理</td></tr><tr><td>ヘキサン (&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>139386-100ML</td><td>脂質溶媒</td></tr><tr><td>自家製 5&amp;times; DNAローディングダイ</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>DNAサンプル調製</td></tr><tr><td>自家製 6&amp;times; Laemmli SDSバッファー（還元剤含有）</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>タンパク質試料の調製</td></tr><tr><td>自家製脱染色液</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>SDS-PAGEゲルの脱染色</td></tr><tr><td>自家製HRV-3Cプロテアーゼ</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>融合タンパク質の切断</td></tr><tr><td>自家製SDS-PAGEランニングバッファー（10&amp;times;)</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>SDS-PAGE電気泳動バッファー</td></tr><tr><td>イミダゾール</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10221</td><td>Hisタグ付きタンパク質の溶出</td></tr><tr><td>バッチ内精製カラム</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>タンパク質精製ワークフロー</td></tr><tr><td>Innova44振盪インキュベーター</td><td>New Brunswick Innova</td><td>M1282</td><td>細胞培養増殖</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Honeywell</td><td>31248-1KG</td><td>電解質および緩衝液の調製</td></tr><tr><td>LBブロス（レノックス）</td><td>Condalab</td><td>1231</td><td>細菌培養</td></tr><tr><td>ロイペプチンプロテアーゼ阻害剤</td><td>Thermo Scientific</td><td>78435</td><td>タンパク質分解の防止</td></tr><tr><td>塩化マグネシウム六水和物</td><td>Acros Organics</td><td>447700010</td><td>緩衝液成分</td></tr><tr><td>NanoDrop分光光度計</td><td>DeNovix</td><td>DS-11</td><td>DNAおよびタンパク質の定量</td></tr><tr><td>n-ドデシル-&amp;beta;n-ドデシル-β-D-マルトシド (DDM)</td><td>NeoBiotech</td><td>NB-19-0056-25G</td><td>膜タンパク質の可溶化</td></tr><tr><td>Ni Sepharose High Performance レジン</td><td>Cytiva</td><td>17526801</td><td>IMAC精製</td></tr><tr><td>ノートパソコン</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>装置制御およびデータ収集</td></tr><tr><td>Optima LE-80K 超遠心機</td><td>Beckman</td><td>365668</td><td>膜画分の単離</td></tr><tr><td>ペンタン（&amp;ge;99%)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>236705-100ML</td><td>脂質溶媒</td></tr><tr><td>ペプスタチンAプロテアーゼ阻害剤</td><td>Thermo Scientific</td><td>78436</td><td>タンパク質分解の防止</td></tr><tr><td>Phusion GCバッファー (5x)&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F519</td><td>PCRバッファー</td></tr><tr><td>Phusion 高正確性 DNA ポリメラーゼ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F530S</td><td>PCR増幅</td></tr><tr><td>PMSFプロテアーゼ阻害剤</td><td>Thermo Scientific</td><td>36978</td><td>ライシス中のタンパク質保護</td></tr><tr><td>ポリエチレンイミン (PEI)</td><td>臨床科学</td><td>24765-100</td><td>トランスフェクション試薬</td></tr><tr><td>ProteinEle プレキャスト Tris-Glycine ゲル (4%&amp;ndash;20%)</td><td>TransGen Biotech</td><td>DG101-01-V2</td><td>タンパク質分離</td></tr><tr><td>SDS-PAGEゲル電気泳動システム</td><td>Bio-Rad</td><td>1658002FC</td><td>タンパク質電気泳動</td></tr><tr><td>酪酸ナトリウム</td><td>Fisher Scientific</td><td>A11079</td><td>タンパク質発現増強剤</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EL0011</td><td>DNAライゲーション</td></tr><tr><td>T4 DNAリガーゼバッファー (10&amp;times;)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>B69</td><td>ライゲーションバッファー</td></tr><tr><td>サーマルサイクラー (Mastercycler Nexus)</td><td>Eppendorf</td><td>6331000025</td><td>PCR増幅</td></tr><tr><td>トリス塩基</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503-1KG</td><td>緩衝液の調製</td></tr><tr><td>レシチンおよびポリソルベート80添加トリプトーゼ大豆カゼイン酵母酵母抽出物寒天培地</td><td>HiMedia</td><td>M449-5KG</td><td>細菌の平板塗抹</td></tr><tr><td>2本の銀線</td><td>Elements s.r.l.</td><td>&amp;mdash;</td><td>電気生理学用電極</td></tr><tr><td>超遠心濃縮器（分画分子量 50 kDa）</td><td>Merck Amicon</td><td>UFC8050</td><td>タンパク質濃度</td></tr><tr><td>pEG BacMam発現ベクター</td><td>Addgene</td><td>160687</td><td>タンパク質発現</td></tr><tr><td>USBケーブル</td><td>&amp;mdash;</td><td>&amp;mdash;</td><td>アンプとコンピュータの接続</td></tr></tbody></table>

小型化montal–mueller平面脂質二重層システムを用いた、合成k2pチャネル記録のためのシングルチャネル電気生理学

Single-Channel Electrophysiology Using a Miniaturized Montal&#8211;Mueller Planar Lipid Bilayer System for Recording a Synthetic K2P Channel

平面脂質二重層へのイオンチャネルの機能的再構成は、単一分子レベルでチャネル活性を調査するための戦略を提供します。しかし、従来のMontal–Mueller二重層システムは、通常、かさばる実験装置、手動でのチャンバー組み立て、および比較的大きな記録容量を必要とし、それが試薬消費量の増加を招くだけでなく、配線の延長や外部ヘッドステージによる電気的ノイズの追加要因となる可能性があります。本研究では、小型アンプを統合し、試薬消費量を抑え操作を簡略化した、安定した単一チャネル記録が可能な小型で即時利用可能な二重層プラットフォーム（BLMchipMM）を提示します。本プロトコルでは、単一チャネル電気生理学的測定を行うための本システムの利用方法について説明します。本システムを用いて、合成K2Pチャネル（ancTREK1）を再構成し、再構成および単一チャネル記録を検証するための原理実証テストタンパク質として使用しました。単一チャネル記録の結果、Mg2+フリーの対称K+溶液において電流-電圧関係が示され、そのコンダクタンス値はTREK1チャネルについて報告されている値と一致しました。このK2P様チャネルの再構成に成功したことは、人工膜における単一チャネル解析に対する本システムの有用性を実証しています。

PLB膜の電流–電圧（I–V）特性
バイレイヤー膜（二層膜）の本質的な疎水性により、荷電種は膜を透過できません。しかし、外部電場を印加することでナノメートルサイズの暫定的なポア（孔）の形成が誘導され、それによって膜の透過性とコンダクタンスに影響を及ぼします33。1,2-diphytanoyl-sn-glycero-3-phosphocholineリピッドから形成された人工バイレイヤーの品質を評価するため、タンパク質を挿入しない状態で、膜容量、抵抗、およびI–V特性を評価しました。±20から±200 mVまでの範囲（±20 mV刻み）で一連の電圧ステップを印加し、得られた膜貫通電流を記録しました。データは5 kHzでサンプリングし、2.5 kHzでローパスフィルタ処理を行いました。
膜容量（Cm）および膜抵抗（Rm）は、バイレイヤーの品質を評価するための重要なパラメータです。PLBは等価的な抵抗-容量（RC）回路として記述でき、その中で膜は抵抗と並列に接続された容量コンデンサとして機能します34。容量成分は膜の電荷蓄積能力を反映し、抵抗成分はイオン透過性を反映します。三角波電圧を印加すると、正方形の容量電流応答が生成され、これは以下の式に従って膜容量に比例します：
<img alt="電気回路解析を示す、容量性電流の公式 I_c=C_m(dv/dt) 式。" src="/files/ftp_upload/69903/69903eq1.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="式1">    (1)
ここで、Cmは膜容量、Vは印加電圧、tは時間を表します。膜形成後、バイレイヤーの漸次的な薄膜化により、容量値が時間とともに増加することがあります35。膜を平行平板コンデンサとして考えると、容量は膜の面積および厚さと次のように関連しています：
<img alt="脂質を含む静電容量の公式、方程式、教育用図表、誘電率。" src="/files/ftp_upload/69903/69903eq2.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="方程式 2">    (2)
ここで、εlipidsは脂質コアの誘電率（~2）、ε0は真空の誘電率、Aは膜面積、dは膜厚である36,37。
膜抵抗はオームの法則を用いて決定した33：
<img alt="起電力方程式 Ir=V/Rm 式、電気抵抗の教育用図表。" src="/files/ftp_upload/69903/69903eq3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="式 3">    (3)
ここで、Vは印加電圧、Rmは膜抵抗である。イオンチャネルが存在しない場合、膜電流は0 pA付近に留まり、これはギガオーム（GΩ）範囲の抵抗値に相当する33。
75 µmおよび100 µmの開口部を持つBLMchipMMデバイスにおいて、I–V関係は0から±200 mVの間で線形（オーム）挙動を示した。データの線形フィッティングにより、膜抵抗値は75 µm開口部で847 ± 16 GΩ (n = 6) (Figure 8A、円)、100 µm開口部で980 ± 32 GΩ (n = 7) (Figure 8A、正方形)であった。電流トレースの3 sセグメントで測定したRMSノイズ値は、100 µm開口部で3.1 ± 2 pA (n = 7)、75 µm開口部で2.6 ± 0.1 pA (n = 6)であった。膜の安定性は、合計1時間の期間にわたり約2 min間隔で抵抗を測定することで評価した (Figure 8B)。適切に形成された膜は一貫して1時間以上にわたって安定しており、これはほとんどの電気生理学的実験に十分な時間である。膜は通常、±200 mVまでの印加電位に耐え、不安定な兆候は見られなかったが、個々のバイレイヤーに応じて±220から±300 mVの間で破綻が起こった。100 mVでの電流値が≤0.5 pAであり、容量値が75 µm開口部で40から60 pF、100 µm開口部で60から90 pFの範囲にある場合に、膜はタンパク質挿入に適していると判断された。
<img alt="電圧-電流および抵抗-時間グラフ、バイレイヤー膜チップ研究、データ解析結果。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig8.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="Figure 8"> 
Figure 8: PLBの電気的特性評価。 (A) 75 µmおよび100 µmのアパーチャ上に形成されたバイレイヤーの電流-電圧（I-V）関係。±200 mVの間で線形（オーム）挙動を示している。線形回帰により、膜抵抗値はそれぞれ847 ± 16 GΩ (n = 6)および980 ± 32 GΩ (n = 7)であった。 (B) 2分間隔で1時間にわたり抵抗をモニタリングして評価した膜の安定性。膜は±200 mVまで安定しており、±220から±300 mVの電圧で破綻した。データは平均値 ± 標準誤差（SEM）で示している。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig8large.jpg" target="_blank">ここをクリックして、この図の拡大版を表示してください。</a>
ancTREK1のシングルチャネル挙動の初期特性解析
合成ancTREK1を精製してPLBに再構成し、−120から120 mVまで20 mV刻みの電圧ステッププロトコルを用いて単一チャネル活性をモニターした。単一チャネル記録（図 9Aおよび図 9B）により、K2Pチャネルに特徴的なフリッカリング挙動が認められた38。80 mVにおいて平均電流振幅は13.02 ± 0.78 pA (n = 5) であったが、−80 mVでは電流振幅は−18.72 ± 0.25 pA (n = 5) に増加した（図 9C）。得られたI–V関係は、Mg2+不含の対称200 mMカリウム条件下において、正および負の両電位で測定可能な単一チャネル電流を示した（図 9D）。電流振幅は5 kHzで取得し2.5 kHzでローパスフィルタリングした記録の全点ヒストグラムから推定したため、このI–V関係は網羅的な生物物理学的キャラクタリゼーションではなく、記述的な原理実証として提示している。
<img alt="イオンチャネル活性解析；+80mVおよび-80mVにおける電流トレースと振幅ヒストグラムのグラフ。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig9v2.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="図 9"> 
図 9: 合成ancTREK1の単一チャネル活性。(A および B) それぞれ 80 mV および −80 mV で記録された代表的な単一チャネル電流トレース。点線はチャネル閉鎖レベルを示す。(C) 正電位（左）および負電位（右）における全点振幅ヒストグラム。(D) 2価カチオンを含まない対称 200 mM カリウム (K+) 条件下でのancTREK1のI–V関係。曲線は4次多項式を用いてフィッティングされており、コンダクタンス値は ±80 mV における勾配から導出されている。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig9largev2.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
ancTREK1は、哺乳類のTREK1チャネルと比較してN末端およびC末端の延長領域を欠いているが、再構成後も機能的に活性を維持していた。高コンダクタンスモードと低コンダクタンスモード（正電位においてそれぞれ132 ± 5 pSおよび41 ± 5 pS）を示す哺乳類TREK139とは対照的に、ancTREK1は大きなコンダクタンスモードのみを示した。正電位における単一チャネルコンダクタンスは112.8 ± 10.8 pS（80 mV, n = 5）であり、これはTREKチャネルの報告値（対称カリウム条件下で85–130 pS）38,39,40,41と一致していた。負電位では、コンダクタンスは205.6 ± 2.05 pS（−80 mV, n = 5）に増加し、これは以前に報告されたTREK1の挙動39と一致していた。注目すべき点として、ancTREK1は、切り出されたパッチ構成を用いて得られたTREK1の測定値42と比較して、より高い正規化開口確率（NPo）を示した。NPo–電圧関係では、正電位でチャネル活性の増加が見られ、80 mVで0.78 ± 0.02（n = 5）に達した。対照的に、NPoは負電位で減少し、−80 mVで0.53 ± 0.04、−120 mVで0.28 ± 0.03となった（図10）。
<img alt="イオンチャネル電気生理学の結果。NPo 対 電圧 (mV) グラフ、棒グラフによる比較、データ解析。" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/69903/69903fig10.jpg" data-altupdatedat="1792468814000" data-alt="図10"> 
図10: ancTREK1 単一チャネル活性の電圧依存性解析。膜電位の関数としての正規化オープン確率 (NPo) (左) および 80 mV と −80 mV における NPo の比較 (右) を示しており、正の電位でチャネルの開口が増加していることがわかる。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/69903fig10large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。</a>
補足図1. 合成された祖先型2ポアドメインカリウム（K2P）チャネル（ancTREK1）のアミノ酸配列。電気生理学的記録に使用したancTREK1の全長アミノ酸配列。この配列は、UniProtおよびNCBIデータベースから収集したオルソログ配列を含むTREK/TRAAKファミリーメンバーの精選データセットから、保存されたポアモチーフでフィルタリングし、アライメントを行い、最大尤度系統解析を用いた祖先配列推定によって再構築された。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/69903/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">こちらのリンクからファイルをダウンロードしてください。</a>

本プロトコルでは、安定したシングルチャネル記録を行うために、増幅機能を統合した小型化Montal–Mueller平面脂質二重層システムの使用方法について説明します。本手法の実証として、精製された合成K2Pチャネルを再構成し、システムの性能を検証します。

小型化Montal–Mueller平面脂質二重層システムを用いた、合成K2Pチャネル記録のためのシングルチャネル電気生理学

イオンチャネルを平面脂質二分子層へ機能的に再構成することは、単一分子レベルでチャネル活性を調査するための戦略となります。

我々の研究は、構造生物学と電気生理学的手法を統合し、イオンチャネルやトランスポーターがどのように機能するかを解明することに重点を置いています。従来のバイレイヤー（脂質二重層）セットアップには、複雑な装置と手作業による組み立てが必要でしたが、本プラットフォームは小型アンプを統合した、小型で即時利用可能なシステムとなっています。まず、機器の校正を行い、銀電極または塩化銀電極を準備して、電気生理学的なセットアップを整えます。2本の銀線の非塩素化端をプリント回路基板（PCB）のソケットに挿入します。電極の塩素化端を、ポリメタクリル酸メチル（PMMA）コンポーネントに開けられた流路に配置します。ブラックリピッド膜チップ（BLMchipMM）をゆっくりと回転させ、PMMA記録チャンバーの下部歯を専用スロットにはめ込み、PCBに取り付けます。このとき、電極線が流路の端まで到達していることを確認してください。セプタム開口部の前処理用に、100% n-ヘキサンを用いた1%（v/v）ヘキサデカン溶液を100 µL準備します。1,2-ジフィタノイル-sn-グリセロ-3-ホスホコリン（DPhPC）脂質を100% n-ペンタンに再懸濁し、最終濃度を15 mg/mLに調製します。1 M 塩化カリウムストック溶液3 mLと1 M HEPESストック溶液150 µLを混合し、室温で電解質記録溶液を調製します。超純水を加えて最終容量を15 mLとし、この溶液を4 °Cで最大1週間保存します。ピペットチップを用い、セプタム開口部の両側に1% (v/v) ヘキサデカン/n-ヘキサン溶液を2 µLずつ滴下して前処理します。温度23～25 °C、相対湿度45%～50%の条件下で、5分間溶媒を蒸発させます。組み立てたBLMchipMMをアンプに挿入します。USBケーブルでアンプをコンピュータに接続し、データ収集ソフトウェアを起動します。電流範囲を2 nAに設定し、抵抗-容量推定ツールを起動して膜容量と膜抵抗をモニターします。0.2 µmのシリンジフィルターを用いて、記録液をろ過します。周囲を濡らさないように注意しながら、各コンパートメントの開口部下端まで30 µLの記録液を満たします。各コンパートメントの水面に、脂質溶液を約2.5 µLずつ滴下します。その後、2分間溶媒を蒸発させます。一方のコンパートメントの底部に、ピペットチップをほぼ90度の角度で配置します。記録液を約80 µL加え、もう一方のコンパートメントでも同様の操作を繰り返します。ファラデーケージの蓋を閉じ、電流信号をモニターします。膜容量を評価するため、10 Hzで100 mVの三角波電圧を印加します。膜抵抗を評価するため、±200 mVまで20 mV刻みで電圧ステップを印加します。サンプリングレート5 kHz、低域通過フィルタ 2.5

single-channel-electrophysiology-using-miniaturized-montalmueller

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小型化Montal–Mueller平面脂質二重層システムを用いた、合成K_2Pチャネル記録のためのシングルチャネル電気生理学

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