ショウジョウバエ胚上皮におけるコアプリーツセプテート接合タンパク質の定義を目的とした免疫染色および染料浸透実験

私たちの研究は、セプテート接合タンパク質の発生的非閉塞機能を調査し、構造や生物学的役割に関与する新たな成分の特定と特徴付けに焦点を当てています。このプロトコルはショウジョウバエ胚の外胚葉上皮におけるプリーズ状中隔接合部の組織および閉塞機能を特徴づけることを目的としています。まず、適切な遺伝子型の健康なオスとメスのショウジョウバエを交配し、酵母ペーストを塗った新鮮なリンゴジュースプレートをつけて胚採取ケージに入れます。

成虫がリンゴジュースの皿に受精卵を産むのを許してください。卵子採取ケージからプレートを取り出し、産卵後13〜16時間、25度の温度で胚を16段階に熟成させて16段階に到達させます。次に、ステージ16胚を適切な固定液に固定し、所望の抗体で免疫染色を行います。

最良の結果を得るためには、40倍油浸漬対物レンズ付きの共焦点顕微鏡で胚を画像化してください。関心のある胚に焦点を合わせた後、レーザーの強度と利得を設定し、ピクセルを過剰飽和させない強い蛍光信号を得ます。中腸形態を用いて、バランサーコードされた緑色蛍光タンパク質を発現しないステージ16胚を特定します。

スキャンは唾液腺または後腸に焦点を合わせ、Zスキャンは内腔の直径をできるだけ大きく含める位置にして、上皮細胞の外側膜全体を可視化します。適切なライン平均を設定し、少なくとも20個の対照胚と20個のCora 4変異期16期胚で偏光組織を画像化します。接着マーカーが膜の頂端側側に強く局在している胚のデータのみを記録してください。

野生型のステージ16胚では、外側膜の先端部、接着部近くに沿ったプリーツ状中隔接合タンパク質の濃縮を評価します。変異体の側膜全体に広がるプリーツ状の中隔接合マーカーの持続分布を記録します。新鮮な染料溶液として、ローダミン標識された10キロダルトンデキストランをpH7.5の0.5モルリン酸ナトリウムに溶かして1ミリグラム/ミリリットルに溶かし、塩化カリウム5ミリモルを加えます。

ニードルプラーを使い、外径1ミリメートル×内径0.5ミリメートルの毛細管とファイバーをガラス針に引き込みます。次に、ガラス針をマイクロマニピュレーターの針ホルダーに装着し、逆さま顕微鏡の隣に配置します。針を顕微鏡スライドにできるだけ平行に向け、スライドの側面と同じZ面に下げます。

針の先端を顕微鏡スライドの側面に当てて折ります。針をスライドの高さより上に上げて、装填のために取り出します。次に、最小のピペットチップを使って毛細管に染料を充填します。

詰めた針を針ホルダーに再装填してください。顕微鏡スライドの表面にあるハロカーボン油の滴に少量注入して、10キロダルトンのデキストランの流れをテストします。22×22ミリメートルの2厚カバースリップを使って、リンゴジュースプレートにへこみ線を作ります。

コントロールの胚とCora 4のミュータントをそれぞれ25個ずつステージ16または17に並べて、リンゴジュースプレートに並べます。後端が線に沿って一直線に並び、腹面が上を向いていることを確認してください。次に、22×22ミリメートルの2番カバースリップに両面テープを貼ります。

テープを胚のラインに触れ、カバースリップを軽くこすって胚をプレートから両面テープに移します。次に、顕微鏡スライドにハロカーボン油を一滴加え、カバースリップをスライドに取り付けます。毛細管の作用で結合が形成されます。カバースリップをスライドの側面、すりついた部分の反対側に合わせてください。

胚を乾燥剤の容器で3〜5分間乾燥させ、胚全体をハロカーボン油で覆います。胚が入ったスライドを逆立顕微鏡に取り付け、胚は対物レンズから上向きに反対側を向きます。マイクロマニピュレーターを、針が胚の後端にできるだけ平行な角度で向くように整列し、マイクロマニピュレーターのZ軸を調整して、針先が胚の背側腹側軸の中心点に合うように調整します。

次に、段階を素早く針の中に移動させて胚を注射し、針の先端が血筋に入るようにします。10-25ミリットルまたは50ミリリットルの注射器を使って約0.2〜0.5ナノリットルの染料を注入します。素早く針を抜き、次の胚に段階を移して造影剤を注入します。

その後、胚の上にさらにハロカーボンオイルを加えます。胚を22×22ミリメートルのナンバー2カバースリップで覆い、カバースリップの間に均一な油層を作り、押しつぶしを防ぎます。デキストラン染料注入後、蛍光化合物顕微鏡または共焦点顕微鏡でイメージングを行います。

共焦点顕微鏡で、背側-腹側軸に沿って胚の深さの約4分の1にZスタックを取得し、気管の腔を評価します。気管、唾液腺、後腸の腔内を検査し、標識されたデキストランの蓄積を観察してください。各胚の遺伝子型と発生段階、そしてラベル付きデキストランが管状器官に蓄積しているかどうかを記録します。

周囲膜腔が強く染み込まれている胚は、誤ってその空間に注入された可能性があることに注意してください。野生型胚では、マクログロブリン補体関連(Mcr)はステージ13で側膜に沿って均一に局在し、ステージ14で側膜の頂端領域に濃縮し、ステージ16では付着接合部の基部に強く局在していました。皮質抗体染色により、ステージ16野生型胚の成熟したプリーツ中隔接合部がMcrと同様の形で特定されました。

Cora 4変異胚では、Mcrはステージ16までに強い頂端局在を達成できず、側膜に沿って分布したままでした。野生型胚およびCora 4変異体第16期胚でもE-カデリン局在は類似していました。ローダミン標識された10キロダルトンデキストランを注入した野生型ステージ17胚では、染料は気管を包囲していましたが、内腔には浸透しませんでした。

Cora 4の変異したステージ17胚では、注射から10分以内に気管腔内に染料が蓄積しました。このプロトコルにより、研究者はショウジョウバエ胚組織におけるプリーツセプート接合部のコア成分か付属成分を識別する遺伝子を自信を持って特定できます。この技術を行う際には胚の段階段階が絶対に重要で、これはステージ16の胚を必要とするためです。

中隔接合部は時間とともに成熟し、ステージ16で完全に定着します。このプロトコルは、RNA干渉線を用いたオープンエンド遺伝子スクリーニングで効果的に実装できると考えています。