Name: マンモスフィアアッセイが非腫瘍性乳腺上皮細胞株におけるApi5誘導幹性を明らかに (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-02-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 5 s
Description: 学ぶマンモスフィアアッセイを用いて非腫瘍性乳腺上皮細胞MCF-10AにおけるApi5過発現によるがん幹細胞様特性の誘導と自己更新能の評価方法。このプロトコルは分子標的治療薬のスクリーニングに応用可能です。

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1. 組織培養プレートにポリ(2-ヒドロキシエチルメサクリレート)、pHEMAをコーティングする
<ol>
	<li>分子量300,000のpHEMA1.2gを95%エタノール100mLに65°Cで絶えずかき混ぜて1.2%のpHEMA溶液を準備します(材料 表参照)。</li>
	<li>標準的な組織培養プレートにpHEMAを塗布し、6ウェルプレートのウェルごとに1mLを塗布します。pHEMA溶液の体積は、組織培養容器の大きさに応じて調整可能です。</li>
	<li>皿は40°Cのオーブンで無菌状態で乾燥させます。</li>
	<li>プレートをUV光に15分間当て、その後Dulbeccoのリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で3回洗浄した後、マンモスフィア形成アッセイのセットアップを行います。</li>
</ol>
2. 一次世代のマンスフィアのシーディング
<ol>
	<li>培養3D解離されたMCF10A細胞(対照およびApi5過剰発現)は、培養培地で16日目の3D培養を解離して得られました。14。 注:培養培地の組成:高グルコースDMEM(ピルビン酸ナトリウムなし)、5%の馬用血清、10 μg/mLインスリン、0.5 μg/mLヒドロコルチゾン、20 ng/mL組換えヒト表皮成長因子(EGF)、100 ng/mLのコレラ毒素、および200単位/mLのペニシリン・ストレプトマイシンを補足します( 材料表参照)。</li>
	<li>使用済み培地を取り出し、細胞を1 mLのDPBSで洗浄し、0.05%トリプシン-EDTAを500 μL加えて、37°Cの加湿5%CO2インキュベーターで12〜15分間インキュベートし、すべての細胞がトリプシン化されるまで培養します。</li>
	<li>すべての細胞が取り除かれた後、トリプシン活性を中和するために2mLの再懸濁培地を加え、112× g で室温で10分間細胞懸濁液を回転させます。 注:再懸濁培地の組成:ピルビン酸ナトリウムなしの高グルコースDMEMに20%馬血清、および200単位/mLのペニシリン・ストレプトマイシンを補足。</li>
	<li>上清液を吸引し、細胞ペレットを1mLのマンモスフィア培地に再懸濁させます。セルサスペンションを25Gの針に通すと、シングルセルサスペンションが得られます。 注:マンモスフィア培地の組成:DMEM/F12に20 ng/mL表皮成長因子(EGF)、ビタミンAなしの×B27サプリメント1個、およびペニシリン・ストレプトマイシン200単位/mL( 材料表参照)。</li>
	<li>ヘモサイトメーターを使い、細胞数を数え、1井戸あたり0.2個×10個4 細胞をシードするのに必要な細胞懸濁量を計算します。 注意:マンモスフィア形成効率を正確に測定するために、低密度のシードを維持し、細胞凝集の影響を最小限に抑えましょう。免疫ブロッティングのためにタンパク質溶解液を採取する際、細胞密度は1ウェルあたり最大2.5個×10個5細胞まで増加させることができます。</li>
	<li>必要な細胞懸濁液を2 mLのマンモスフィア培地で希釈し、6ウェルプレートの各ウェルにシードします。種子細胞は各条件ごとに三倍ずつ。</li>
	<li>加湿した5%CO2インキュベーターで37°Cで7日間培養します。</li>
	<li>培養7日後、各ウェルで直径50μmを超えるマンモスフィアの数を手動で数えます。これは、グラティクル付きの顕微鏡を使ったものか、光学顕微鏡下の象限グリッドを用いて行われます。</li>
	<li>光学顕微鏡に取り付けたデジタルカメラを20倍倍で撮影します。</li>
	<li>マンモスフィア形成効率(MFE)は次の式5で計算します。 
	 <img alt="式1" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq1v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 1"></li>
</ol>
3. 二次世代のマンスフィアの播種
<ol>
	<li>第一世代で形成されたマンモスフィアを15mLのチューブと遠心分離機で300×gで室温で10分間採取します。</li>
	<li>上清液を吸引し、マンモスフィアのペレットは残します。</li>
	<li>ペレットはDPBSで洗ってください。</li>
	<li>マンモスフィアペレットに0.05%トリプシンEDTAを200 μL加え、37°Cの加湿5%CO2インキュベーターで2〜3分間培養します。トリプシン溶液中のマンモスフィアを25Gの針に3回通し、単細胞懸濁液を得る。</li>
	<li>トリプシン活性を中和するために0.5mLの懸濁培地を加え、112× g で室温で10分間細胞懸濁液を回転させます。</li>
	<li>上清液を吸引し、細胞ペレットを0.5 mLのマンモスフィア培地に再懸浮させます。</li>
	<li>ヘモサイトメーターを使い、細胞数を数え、1ウェルあたり0.2 ×10個4 細胞をシードするのに必要な細胞懸浮体積を計算します。 注意:自己更新能力を評価するために細胞密度を低く保ち、細胞凝集の影響を最小限に抑えましょう。</li>
	<li>必要な細胞懸濁液を2 mLのマンモスフィア培地で希釈し、6ウェルプレートの各ウェルにシードします。種子細胞は各条件ごとに三倍ずつ。</li>
	<li>加湿した5%CO2インキュベーターで37°Cで7日間培養します。</li>
	<li>培養7日後、グラティクル付きの顕微鏡または四分円グリッドを用いて、各プレートに直径50μmを超えるマンモスフィアの数を数えます。</li>
	<li>光学顕微鏡に取り付けたデジタルカメラを20倍倍で撮影します。</li>
	<li>自己更新能力は次の式5で計算します。 
	<img alt="式2" src="/files/ftp_upload/69999/69999eq2v3.jpg" style="margin: auto;" data-altupdatedat="1783400419000" data-alt="Equation 2"></li>
</ol>
4. Api5過剰発現時の多能性マーカーの変化を検出するためのウェスタンブロット法
<ol>
	<li>第一世代で形成されたマンモスフィアを15mLチューブに収め、室温で300× g の遠心分離機で10分間処理します。</li>
	<li>上清液を吸引し、マンモスフィアのペレットは残します。</li>
	<li>ペレットはDPBSで洗ってください。</li>
	<li>ペレットを氷冷のRIPAバッファーで採取し、タンパク質溶解液を得て標準プロトコル24に従って免疫ブロッティングを行います。 注:RIPAバッファーの組成:50 mM トリスHCl(pH 8.0)、150 mM NaCl、1% トリトンX-100、0.5% デオキシコール酸ナトリウム、0.1% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1 mM エチレンジアミネテトラ酢酸(EDTA)、1 mM フェニルメチスルホニルフッ化物(PMSF)、10 mM フッ化ナトリウム、1 mM オルトバナデートナトリウム。</li>
	<li>茎の兆候(Oct3/4、Nanog、Sox2、Bmi1)のプローブと、負荷制御のGAPDH(抗体希釈については 材料表 を参照)を検出します。</li>
	<li>ImageJの密度測定解析を用いてタンパク質レベルを定量化します。ウェスタンブロット画像で関心のある領域を選択し、各レーンの密度プロファイルを作成します。</li>
	<li>各レーンごとに、関心のあるタンパク質のGAPDH密度との相対的な密度を正規化します。各タンパク質の折りたたみ変化を計算します。</li>
	<li>どんなプロットソフトを使っても、たみの変化をプロットしてください。</li>
</ol>

<ol><li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+resistance+of+tumorigenic+breast+cancer+cells+to+chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Natl+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Intrinsic resistance of tumorigenic breast cancer cells to chemotherapy.</a> J Natl Cancer Inst. 100 (9), 672-679 (2008).</li>
<li>Creighton, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Residual+breast+cancers+after+conventional+therapy+display+mesenchymal+as+well+as+tumor-initiating+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Residual breast cancers after conventional therapy display mesenchymal as well as tumor-initiating features.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (33), 13820-13825 (2009).</li>
<li>Dontu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+propagation+and+transcriptional+profiling+of+human+mammary+stem%2Fprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem/progenitor cells.</a> Genes Dev. 17 (10), 1253-1270 (2003).</li>
<li>Grimshaw, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammosphere+culture+of+metastatic+breast+cancer+cells+enriches+for+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells.</a> Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).</li>
<li>Shaw, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+mammosphere+assay+protocol+for+the+quantification+of+breast+stem+cell+activity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A detailed mammosphere assay protocol for the quantification of breast stem cell activity.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 17 (2), 111-117 (2012).</li>
<li>Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+identification+of+tumorigenic+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 3983-3988 (2003).</li>
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<li>Bousquet, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+expression+of+apoptosis+protein+%28Api-5%29+in+chemoresistant+triple-negative+breast+cancers%3A+an+innovative+target%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">High expression of apoptosis protein (Api-5) in chemoresistant triple-negative breast cancers: an innovative target.</a> Oncotarget. 10 (61), 6577-6588 (2019).</li>
<li>Basset, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Api5+a+new+cofactor+of+estrogen+receptor+alpha+involved+in+breast+cancer+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Api5 a new cofactor of estrogen receptor alpha involved in breast cancer outcome.</a> Oncotarget. 8 (32), 52511-52526 (2017).</li>
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<li>Cho, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor-5+overexpression+is+associated+with+tumor+progression+and+poor+prognosis+in+patients+with+cervical+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor-5 overexpression is associated with tumor progression and poor prognosis in patients with cervical cancer.</a> BMC Cancer. 14 (1), 545(2014).</li>
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<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+increases+metastasis+via+Erk-mediated+MMP+expression%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 increases metastasis via Erk-mediated MMP expression.</a> BMB Rep. 48 (6), 330-335 (2015).</li>
<li>Krejci, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antiapoptotic+protein+Api5+and+its+partner%2C+high+molecular+weight+FGF2%2C+are+up-regulated+in+B+cell+chronic+lymphoid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">The antiapoptotic protein Api5 and its partner, high molecular weight FGF2, are up-regulated in B cell chronic lymphoid leukemia.</a> J Leukoc Biol. 82 (6), 1363-1364 (2007).</li>
<li>Koci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+inhibitor+5+%28API-5%3B+AAC-11%3B+FIF%29+is+upregulated+in+human+carcinomas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">Apoptosis inhibitor 5 (API-5; AAC-11; FIF) is upregulated in human carcinomas in vivo.</a> Oncol Lett. 3 (4), 913-916 (2012).</li>
<li>Phi, L. T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+%28CSCs%29+in+drug+resistance+and+their+therapeutic+implications+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells (CSCs) in drug resistance and their therapeutic implications in cancer treatment.</a> Stem Cells Int. 2018 (1), 5416923(2018).</li>
<li>Zhou, H. M., Zhang, J. G., Zhang, X., Li, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cancer+stem+cells+for+reversing+therapy+resistance%3A+mechanism%2C+signaling%2C+and+prospective+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Targeting cancer stem cells for reversing therapy resistance: mechanism, signaling, and prospective agents.</a> Signal Transduct Target Ther. 6 (1), 62(2021).</li>
<li>Song, K. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((API5+confers+cancer+stem+cell-like+properties+through+the+FGF2-NANOG+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogenesis%22%5BJournal%5D)">API5 confers cancer stem cell-like properties through the FGF2-NANOG axis.</a> Oncogenesis. 6 (1), e285(2017).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255 (5052), 1707-1710 (1992).</li>
<li>Bodakuntla, S., Libi, A. V., Sural, S., Trivedi, P., Lahiri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-nitroso-N-ethylurea+activates+DNA+damage+surveillance+pathways+and+induces+transformation+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">N-nitroso-N-ethylurea activates DNA damage surveillance pathways and induces transformation in mammalian cells.</a> BMC Cancer. 14 (1), 287(2014).</li>
<li>Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eyes+wide+open%3Aa+critical+review+of+sphere-formation+as+an+assay+for+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Eyes wide open:a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 486-498 (2011).</li>
<li>Eyre, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-derived+mammosphere+and+xenograft+tumour+initiation+correlates+with+progression+to+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mammary+Gland+Biol+Neoplasia%22%5BJournal%5D)">Patient-derived mammosphere and xenograft tumour initiation correlates with progression to metastasis.</a> J Mammary Gland Biol Neoplasia. 21 (3-4), 99-109 (2016).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% Trypsin EDTA&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>37 &deg;C humidified incubator</td><td>New Brunswick</td><td>Galaxy 170 R</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Bmi1 Rabbit pAb</td><td>ABclonal</td><td>A13472</td><td>1:1000 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-GAPDH antibody</td><td>Sigma</td><td>G9545-200UL</td><td>1:10000 dilution, 1 h incubation at room temperature</td></tr><tr><td>Anti-Nanog Rabbit mAb</td><td>ABclonal</td><td>A22625</td><td>1:5000 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Oct3/4 Antibody (C-10)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-5279</td><td>1:300 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>Anti-Sox2 Antibody (E-4)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-365823</td><td>1:300 dilution, overnight incubation at 4 &deg;C</td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50x), minus vitamin A</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra X-15R</td><td></td></tr><tr><td>Cholera toxin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C8052-1MG</td><td>&nbsp;1 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>11330032</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal growth factor (EGF)&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>E9644-0.2MG&nbsp;</td><td>100 mg/mL stock in dH2O</td></tr><tr><td>Ethanol absolute 99.9%</td><td>Jebsen &amp; Jessen GmbH &amp; Co. Germany</td><td>58051 L05</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)</td><td>SRL</td><td>43272</td><td></td></tr><tr><td>High glucose DMEM without sodium pyruvate</td><td>Invitrogen</td><td>11965126</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum&nbsp;&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16050122</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl)</td><td>Qualigens</td><td>Q29145</td><td>Used to adjust pH of Tris-HCl (pH 8.0)</td></tr><tr><td>Hydrocortisone&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;&nbsp;</td><td>H0888</td><td>1 mg/mL stock in ethanol</td></tr><tr><td>ImageJ&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Image processing software</td></tr><tr><td>ImageQuant LAS 4000&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immobilon Western chemiluminiscent HRP substrate</td><td>Merck</td><td>WBKLS0500</td><td></td></tr><tr><td>Insulin&nbsp;</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>I1882&nbsp;</td><td>10 mg/mL stock in 1% glacial acetic acid</td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS-100 microscope</td><td>Nikon</td><td>BM-1919</td><td></td></tr><tr><td>MCF10A cells</td><td></td><td></td><td>Gift from Prof. Raymond C. Stevens (Scripps Research Institute, USA)</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin&nbsp;</td><td>Lonza&nbsp;</td><td>17-602E</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethysulphonyl fluoride (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>78830-5G</td><td></td></tr><tr><td>Plotting software&nbsp;</td><td>GraphPad Prism 10</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Poly(2-hydroxyethyl methacrylate) (pHEMA)</td><td>Santacruz</td><td>sc-253284</td><td>1.2% pHEMA in 95% ethanol</td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>SRL</td><td>41721</td><td></td></tr><tr><td>Sodium deoxycholate</td><td>Amresco</td><td>0613-100G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulphate (SDS)</td><td>SRL</td><td>54468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium fluoride (NaF)</td><td>HiMedia</td><td>RM1081-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium orthovanadate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6508-10G</td><td></td></tr><tr><td>Tris buffer</td><td>SRL</td><td>71033</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T8787-250ML</td><td></td></tr></tbody></table>

マンモスフィアアッセイが非腫瘍性乳腺上皮細胞株におけるapi5誘導幹性を明らかに

Mammosphere Assay Reveals Api5-Induced Stemness in Non-Tumorigenic Breast Epithelial Cell Lines

非接着条件下でのマンモスフィア形成効率を評価するため、プロトコルに従い、対照細胞およびApi5過剰発現した3D解離MCF10A細胞をポリHEMAコーティングプレートにシードしました。Api5過剰発現細胞は対照群に比べて平均乳球形成効率が1.58倍向上を示しました(図1B,C)。この増加は、Api5の発現が高いほど、非接着性で血清欠乏状態で存続・増殖する幹細胞様前身の割合が増加し、クローン由来の球体が形成されることを示しています。
一次マンモスフィアは集められ、解離され、再播種されて第二世代のマンモスフィアが形成されました。Api5過剰発現細胞は対照細胞の平均自己更新能力をほぼ2.5倍に示しました(図1D,E)。この結果は、Api5の過剰発現が自己更新する幹細胞様細胞のプールを増加させ、これらの細胞の連続回通における維持を支えることを示唆しています。
<p class="jove_conte...

マンモスフィアアッセイが非腫瘍性乳腺上皮細胞株におけるApi5誘導幹性を明らかに

Breast cancer remains the most prevalent cancer among women globally, with the highest age-standardised incidence and mortality rates. Despite the ...

mammosphere-assay-reveals-api5-induced-stemness-non-tumorigenic

Research

JoVE Journal

Cancer Research

がん研究

このビデオでは、乳がん細胞株からがん幹細胞を分離する方法を説明しています。これらのがん幹細胞を培養して初代マンモスフィアを作製し、自己複製の評価と球体形成効率の計算を行い、異なる播種密度間での比較を可能にします。...

初代マンモスフィアの作製:細胞の効力を決定する技術

ヒト乳腺外科廃棄材料を処理する方法が記載されている。オルガノイドの形で処理された組織は、無期限に凍結したり、長期的な成長のための文化に入れ保存することができます。この方法は、実験的な正常なヒト上皮細胞生物学の検査、および外因性の摂動の効果を可能にします。...

細胞培養のための人間の削減乳房形成や乳房切除組織の処理

タイムラプスイメージングは​​、特定の行動のパラメータと異なる遺伝的病変の間に相関があるかどうかを判断するために乳癌リスクの遺伝子改変モデルマウス由来の初代前腫瘍性乳腺上皮細胞の挙動を評価するために使用される。...

乳がんの遺伝子改変マウスモデル由来の初代前癌乳腺上皮細胞のタイムラプスイメージング

無傷の組織オルガノイドを用いた初代培養細胞は、多細胞のin vivoでの微小環境を模倣するモデル系を提供する。我々は、酵素的組織破壊することなく、形態分化混合細胞培養系統や展示を永続無血清原発性乳房上皮組織培養モデルを開発した。乳オルガノイド&gt;は6ヶ月間生存したまま。...

マンモスフィアの自然発生の事前侵襲乳房病変の非酵素的、無血清組織培養

マルチとシングルセルベース球アッセイを用いてヒト卵巣癌細胞における幹細胞特性の評価

フローティングマンモスフィアアッセイは、マウスに移植すると懸濁状態で生存し、腫瘍形成が促進される幹様乳がん細胞のサブセットを調査することができます。 このプロトコルは、in vivo腫瘍形成の代理である球形成能力の便利なin...

ヒト乳癌組織および細胞株からマンモスフェア形成アッセイ

この方法論の目的は、癌細胞株および原発ヒト腫瘍試料中の癌幹細胞(CSC)を、細胞細胞の機能性アッセイと表現型特性評価を用いて堅牢に同定することである。しみ。...

婦人科腫瘍および乳がん腫瘍から癌幹細胞球体を取得する

ここでは、インビトロマンモスフィア自己再生定量アッセイの実施と解釈について説明する。...

マウスマンモスフィア培養における自己再生の定量

このプロトコルは、ヒト乳腺細胞の形質転換を評価するための実験的なインビトロツールを提供する。細胞増殖率、アンカレッジ非依存性増殖能、基基膜マトリックスを用いた3D培養における細胞系統の分布をフォローアップするための詳細なステップについて説明する。...

ヒト乳腺上皮細胞における発癌性転換のインビトロ評価

この実験プロトコルでは、乳がん細胞および組織サンプルからのBCSCの単離、ならびにBCSCの表現型と機能を評価するために使用できるin vitro および in vivo...

細胞および組織サンプルからのヒト乳がん幹細胞の単離と機能評価

本プロトコルは、マウス乳腺における並行 したin vivo...

マウス乳腺における遺伝子ノックアウトと活性化の並行 生体内 スクリーニング

学ぶマンモスフィアアッセイを用いて非腫瘍性乳腺上皮細胞MCF-10AにおけるApi5過発現によるがん幹細胞様特性の誘導と自己更新能の評価方法。このプロトコルは分子標的治療薬のスクリーニングに応用可能です。

マンモスフィアアッセイが非腫瘍性乳腺上皮細胞株におけるApi5誘導幹性を明らかに

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