行動実験に基づくゼブラフィッシュ幼虫におけるMPTP誘導パーキンソン様行動表現型の表現型プロファイリング

私たちは、幼生ゼブラフィッシュにおける運動型および非運動型パーキンソン病の表現型を包括的にプロファイリングするためのマルチパラメトリック行動プロトコルを提示します。このプロトコルはパーキンソン病のモデリング、薬物スクリーニング、環境神経毒性、魚の幼虫を用いた研究に適用されます。まずは、手袋、実験用コート、防護用眼鏡など、適切な個人用防護具を着用してください。

100xE3ストック溶液を1対100の比率で超純水と希釈し、単一濃度の培地を準備します。次に、性的に成熟したオスとメスの成体ゼブラフィッシュを選択します。取り外し可能な仕切り付きの繁殖タンクを使い、制御繁殖を行います。

午後8時に、オスとメスのゼブラフィッシュを繁殖用水槽の別々のセクションに配置し、オス2匹対メス3匹の比率で分けて隔離します。翌朝8時に、交尾のために仕切りを外します。胚を1時間後に採取し、きれいなシステム用水で3回洗います。

胚は新鮮なE3培地20ミリリットルを含む100ミリメートルのペトリ皿に収容します。その後、胚を28度Cで14時間の光と10時間の暗いサイクルで抱卵します。受精後1日目に、受精していない、奇形、異常な胚を牧草ピペットで慎重に取り出してください。

培地をペトリ皿の端からゆっくり吸引し、新鮮なE3胚培養皿をペトリ皿の壁に沿って添加して野生型胚への影響を最小限に抑えます。MPTP処理群には50マイクロモルのMPTP溶液を使用します。受精から4日後、3ミリリットルの牧草ピペットの先端から10ミリメートル切り、広いボアを作ります。

午後6時に改造ピペットを使って各グループからゼブラフィッシュの幼虫を選び、1つのウェルに1匹の幼虫を96ウェルのプレートに移します。各井戸を立体顕微鏡で観察し、すべてのゼブラフィッシュ幼虫が健康であることを確認しましょう。フィンが開いて定期的に揺れているか、体が直立していること、そして水泳用ラダーが膨らんでいるかを確認してください。

次に、プレートの底面を丁寧に掃除し、汚れがビデオトラッキング結果に影響を与えないようにしましょう。次に、96ウェルプレートをゼブラボックスチャンバーの中央に移します。ビデオトラッキングソフトでクオンタイズモードを選択します。

睡眠覚醒の調整をモニターするには、照明調整を午後10時に消し、午前8時に点灯するように設定してください。ソフトウェアパラメータを設定し、検出閾値を40、バーストを25、フリーズを4、合計監視時間を52時間、そして60秒に設定します。8時に睡眠覚醒手順を開始し PM.To 光運動反応をモニターし、受精後5日目に幼虫を96ウェルのプレートに1個の幼虫を入れます。次に光の移行プログラムを0秒から60秒間の暗闇に設定し、その後60秒から120秒間の一定光を保ちます。

プロトコルを開始し、120秒間のアッセイ中6秒ごとに動作パラメータを収集します。プロトコルを120秒で停止し、データファイルをエクスポートします。その後、幼虫を完全な暗闇に5分間置き、次の暗いストロボライト検査に備えます。

ライトトランジションプログラムを10ヘルツで60秒間ストロボライトを照射するように設定してください。Thigmotaxisを評価するために、6ウェルプレートを2枚選びます。各井戸にE3中質4ミリリットルを満たします。

受精後5日目に、野生型グループとMPTP処理グループからゼブラフィッシュの幼虫を採取し、別々の6つのウェルプレートに入れます。Thigmotaxis評価の前に、井戸板をゼブラボックスに15分間置いて慣れさせます。次に、掘り面積関数を使って、井戸の半径の内側の円半径が井戸の半径に等しい同心円を2つ描き、評価を開始します。

運動評価のために、野生型グループとMPTP処理グループから5日齢のゼブラフィッシュ幼生を2つの別々の12ウェルプレートに移します。15分間の順応後、オンライン追跡分析モードを選択し、自動ビデオ追跡システムを使って5分間の運動活動を記録します。驚き反応テストでは、5日生幼虫を12ウェルの2枚のプレートに個別に移し、各ウェルに1匹の幼虫と2ミリリットルのE3培地を投与します。

プレートをゼブラボックスに入れて、5分間の軽い順応期間を設けます。ZebraLabソフトウェアを起動し、追跡オンライン分析モードを起動してください。光のトリガーインターフェースを開き、下記の3つのトリガー方法のいずれかを選択して強化刺激を有効にしてください。

次に、セッション開始時に開始方法を設定します。トランジションスケジュールで、ダークフラッシュのリズムを定義します。プログラムを21秒後にトリガーし、その後100%光強度で1ミリ秒から5ミリ秒に切り替えます。

2から2に2,890ミリ秒、100%光強度でトランジション。光強度0%で3〜5ミリ秒、光強度0%で4〜100ミリ秒遷移します。定期的な点滅を保証するためにトランジションの繰り返しリストにチェックを入れ、その後プロトコルを開始します。

ライトダークチャレンジアッセイでは、ゼブラフィッシュ幼虫を24ウェルプレート2枚に移し、各ウェルに1匹の幼虫と1ミリリットルのE3培地を投与します。シマウマボックスで5分間の慣れの後、追跡分析オンラインモードをオンにしてください。その後、ライトプログラムを6分間の連続光と4分間の完全な暗闇に設定します。

10分目で行動記録を停止し、データを保存してください。慎重にプレートをシマウマボックスから取り出してください。行動実験の後は、MPTP接触面すべてに新たに調製した次亜塩素酸ナトリウム溶液をスプレーし拭き取ります。

MPTPを含む液体および固体廃棄物を収集し、有害神経毒性廃棄物として明確にラベル付けしてください。汚染されたすべての物質は、新たに調製された次亜塩素酸ナトリウム溶液で処理してください。処理済みのゼブラフィッシュ幼虫は、野生型グループと比較して睡眠および覚醒活動の妨げが見られました。

治療群では総睡眠時間も有意に増加しました。治療群では外出回数が有意に減少し、平均外出時間は増加しました。治療群では覚醒活動および平均活動が有意に障害されました。

一定の光の下で、処理群の凍結指数は有意に増加しました。また、10ヘルツのストロボライト刺激下でも大幅に増加しました。光運動反応曲線では、治療群で反応性が低下しました。

追跡結果は、治療群における運動行動および探索行動の減少を示しました。治療群では総泳速および平均泳速も有意に低下しました。凍結移動時間比は処理群で有意に高かったが、急速移動時間の比率は有意に低かった。

交互に明暗が変化する移行により、野生型幼虫では顕著な速度ピークが現れました。刺激後の距離と刺激後のピーク速度は、治療群で有意に減少しました。治療群では、運動開始のピークまでの遅延も有意に遅れました。

主な課題は、個体の変化を考慮しつつ内部決定因子を最小化し、ゼブラフィッシュレベルで正確かつ再現性の高い行動分析を確保することです。行動的クラスタリングやフェノムプロファイリングを応用し、微妙な神経毒性の影響を明らかにし、より深い磁気的洞察を得ることができます。今後の研究では、このプラットフォームを有害薬物スクリーニングやゼブラフィッシュ・パーキンソン病モデルの薬理学的評価に応用できる可能性があります。