中枢神経系病原体検出のための脳脊髄液のメタゲノミック次世代シーケンシング

これは脳脊髄液サンプルのメタゲノミック次世代シーケンスを研究ベースに基づき、サンプル内の潜在的な病原体を検出するためのプロトコルです。既存のMNGSプロトコルでは、CSF内のRNA収量の低さを考慮していません。このプロトコルは、これらのサンプル中のバイオマスが少ないことを考慮して複数のステップを最適化しています。

氷上でCSFサンプルを解凍するには、各サンプル1ミリリットル分100マイクロリットルを1.5ミリリットルのチューブに移し、遠心分離機で16,000G、4度Cで10分間投与します。その後、上清液を慎重にピペットで取り除き、ペレットと100マイクロリットルの上清液を残します。残りの100マイクロリットルの上清液とペレットに加え、100マイクロリットルのDNARNAシールドを加え、十分に混ぜます。

次に600マイクロリットルのDNA RNA溶解バッファーを加え、ピペッティングで溶液が均一になるまで混合します。製造元の指示に従って、以下の重要な修正を加えてDNAおよびRNA抽出プロトコルを実行してください。すべての遠心分離工程を最大速度で1分間行い、最終的なDNARNA洗浄は3分間遠心分離してください。

試料を溶出するには、22マイクロリットルのヌクレアーゼフリー水をカラムマトリックスに直接加えます。その後、室温で3分間培養します。エルシアンピペットの後、流れを再びカラムマトリックスに戻し、最大速度で再度1分間遠心分離した後、サンプルを新しい1.5ミリリットルの保存チューブに移します。

RNA断片化およびプライミングに必要な成分をPCRチューブ内でピペット化します。加熱された蓋を105度に設定した状態で、チューブを熱サイクラーで孵化させます。ピペットは断片化・プライムされたRNAを、ヌクレアーゼフリー水8マイクロリットルと第一鎖合成酵素ミックス2マイクロリットルと混合します。

加熱された蓋を105度に設定した状態で、チューブを熱サイクラーで孵化させます。次に、最初に合成されたDNA鎖をヌクレアーゼフリー水48マイクロリットルと混ぜます。セカンドストランド合成反応バッファー8マイクロリットル、セカンドストランド合成酵素ミックス4マイクロリットル。

チューブをサーモサイクラーに入れ、蓋を閉めたまま16度で1時間孵化させます。次に、固相可逆固定磁気ビーズの1.8倍比率を用いて磁気ビーズ精製を行います。サンプルをヌクレアーゼフリー水53マイクロリットルに溶出します。

精製された二本鎖CDNAを含む最終上清液50マイクロリットルを、クリーンなヌクレアーゼフリーPCRチューブに移します。この時点で、サンプルは一晩マイナス20度で凍結することができます。もしサンプルがマイナス20度の環境で一晩保存されていた場合は、氷で解凍してから再加熱してください。

ピペットで50マイクロリットルの精製二本鎖CDNAと7マイクロリットルの終端反応バッファー、3マイクロリットルのエンドプレゼン酵素ミックスを混合します。サンプルをサーモサイクラーに入れ、20度Cで30分、65度で30分ずつ培養し、蓋を温めて保存します。次に、氷上でアダプターライゲーションのステップを行い、まずヌクレアーゼフリーの水中でアダプターの希釈を1から100にします。

最終準備反応混合物を、30マイクロリットルのライゲーションマスターミックス、1マイクロリットルのライゲーションエンハンサー、2.5マイクロリットルの希釈アダプターを含むチューブにピペットで移します。サンプルをサーモサイクラーに入れ、蓋を閉めたまま20度で15分間培養します。その後、固体相可逆固定磁気ビーズの0.9倍比率を用いた磁気ビーズの精製に直行します。

次に、ヌクレアーゼフリーの17マイクロリットルの水に溶出します。最終上清液15マイクロリットルをクリーンなヌクレアーゼフリーPCRチューブに移管します。ピペット精製アダプターがCDNAを3マイクロリットルのユーザー酵素、25マイクロリットルのQファイブマスターミックス、10マイクロリットルのユニークなバーコードプライマーをチューブに結成しました。

加熱された蓋を105度に設定した状態でチューブを熱サイクラーに入れ、提示された条件で孵化させます。最終的に0.8倍の磁気ビーズを用いて純化を行います。次に、サンプルをヌクレアーゼフリー水23マイクロリットルに溶出します。

最終上清液20マイクロリットルを、ヌクレアーゼフリーのクリーンなPCRチューブに移します。DNA定量キットと対応する蛍光計を用いてサンプルライブラリの濃度を定量します。水質管理の濃度が他のサンプルと比べて大幅に低いか、定量化できないかを確認してください。

自動毛細管電気泳動装置でサンプルを運用してサンプルライブラリのサイズを評価します。オープンソースのウェブベースプラットフォームであるChan Zuckerberg IDを使って、病原体検出のためのメタゲノム解析を行います。チャン・ザッカーバーグIDにログインし、アップロードをクリックしてください。

メタゲノミクスを解析タイプとして選択し、シーケンス実行から入力されたFASTQファイルを選択します。必要なサンプル情報(サンプル名、サンプルタイプCSF、ヌクレオチドタイプRNAまたはDNA)を入力してください。処理が完了したら、サンプルを含むプロジェクトフォルダをクリックして、要約ダッシュボードに移動します。

下にスクロールして、サンプルごとのリード数を確認してください。品質管理フィルタリングに合格したリードの割合と重複圧縮比を確認し、バイアスPCRと増幅のバイアスを評価します。プロジェクトフォルダ内の異物DNA汚染を特定するには、各水管理サンプルを選択し、背景モデルをクリックしてモデルを生成してください。

分析中はモデルを適用し、閾値フィルターを使ってNTZスコアを1より大きく設定し、可能性のある汚染物質を除去します。その後、適切な統計ソフトウェアを使ってデータを分析します。毛細血管電気泳動および電気泳動データは、CDNAサンプルライブラリが過剰に断片化されており、シーケンス用ではないアダプターダイマーを含むことが示されました。

CDNAライブラリーは、アダプターによるダイマー汚染がほとんどなく、プール化とシーケンスの準備が整いました。CSFメタゲノム次世代シーケンシングにより、コホートAおよびBの73.5%、コホートBサンプルの51.2%で少なくとも1つの病原体が検出されました。重要な課題は、低量ピペッティングと時間に敏感なB乾燥による精密ピペッティングであり、乾燥不足や過剰乾燥は結果に影響を及ぼします。

このプロトコルは病原体検出側に重点を置いていますが、このプロトコルによって生成される宿主RNA転写産物は追加の下流解析にも利用できます。したがって、今後の研究では、この特定のライブラリの調製およびシーケンスプロトコルの性能を、スパースサンプル向けに設計された新興手法と比較し、病原体検出だけでなくトランスクリプト体解析の面でもどのように整合するかを見ることが重要です。