二相酸溶媒法を用いたマウス糞便からの短鎖脂肪酸の抽出

このプロトコルにより、低入力マウスの糞便サンプルから短鎖脂肪酸(SCFA)を抽出し、定期的なガスクロマトグラフィー解析を可能にします。アセテート、プロピオン酸、酪酸を含むSCFAは、食物繊維の発酵を通じて腸内細菌叢によって生成されます。行動的、代謝的、生理的な表現型と関連しているため、広く研究されています。

しかし、糞便サンプル中のSCFAsの定量化は依然として困難です。これらの代謝物は揮発性で、しばしば低濃度で存在し、複雑な生物学的行列で測定されます。マウスの研究では、各動物から採取される糞便の量もしばしば限られています。

標準的な手法では、派生化、比較的大きなサンプル量、または専門的な機器が必要になる場合があります。ここでは、希釈された塩酸とエチル酢酸を用いて、低入力マウス糞便サンプルからSCFAを抽出するための二相酸溶媒抽出ワークフローを、通常のGC分析に適した形式で紹介します。では、正しい配置から始めて、残りのプロトコルを進めます。

次に、冷凍された糞便サンプルを正しくラベル付けしたサンプルボックスを用意します。次に、1000マイクロリットルのピペットを255に設定します。これで標示された塩酸希釈が得られます。

私たちは引き続き各サンプルにHClを割り当てます。今度はピンセット用の掃除井戸にエタノールを入れます。今では、同じエタノールを使って乳棒の浴槽を作ります。

今度は糞便サンプルを遠心分離機バイアルに入れます。今では、清潔な乳棒を使ってそれぞれの遠心分離機の小瓶内で糞便サンプルを粉砕しています。サンプルを採取し、少なくとも10秒間、または完全に混ざるまで渦に塗布します。

混合サンプルを遠心分離機に持ち込み、設置します。遠心分離機の適切なバランスを確保してください。遠心分離機を16,000gに設定し、10分間、4度摂氏で過ごします。

10分経ったら、サンプルを遠心分離機から取り出します。サンプルに合わせて新しい遠心分離バイアルにラベルを貼り直してください。200マイクロリットルのピペットを120に設定してください。

ペレットに触れないように注意しながら、上清液を慎重に取り除きます。上澄液を新しいバイアルに移します。ペレットは捨てていいよ。

新しいバイアルに同じ量のエチル酢酸を加えてください。これらのサンプルを遠心分離機に戻してください。遠心分離機を2,374gに設定し、20分間、摂氏4度で行います。

20分経ったらサンプルを取り出します。サンプルに合わせて新しい遠心分離バイアルにラベルを貼り直してください。ピペットを120マイクロリットルに戻してください。

下層には触れないように注意し、上層だけを取り除く。上澄液を正しくラベル付けされた新しいバイアルに移してください。これらのサンプルはサンプルボックスに移し、さらなる分析まで保管してください。

最後に、サンプルボックスをマイナス80度の冷凍庫に入れます。抽出されたSCFAアリコートは120マイクロリットルで、ガスクロマトグラフィーによる定量前にマイナス80度で保存されました。定量分析により、図に示されているように主要な代謝物である酢酸、プロピオン酸、酪酸を含む8つのSCFAが特定されました。

SCFA分離の検証のため、ガスクロマトグラフィーデータを回収および再現性試験で評価しました。回収率は内部標準濃度が既知の対照サンプルをスパイクアップして評価し、再現性は日中および数日にわたる繰り返し解析で検証されました。まとめると、このプロトコルは低入力マウスの糞便サンプルからSCFA抽出のためのワークフローを提供します。

導出を必要とせず、通常のGCベースの解析と互換性があります。この方法は、多様なマウスモデルにおける糞便SCFA測定を支援できます。