蛍光トレーサーを用いたマウスの歯肉上皮障壁の機能評価

これは、歯肉上皮障壁の完全性を定量的に評価するための標準化されたプロトコルです。このプロトコルは、バリア機能障害疾患の研究や歯肉におけるバリア修復薬の試験に役立ちます。まず、雄の野生型C57BL/6Jマウスを未治療の対照群、結紮誘発性歯周炎群、そしてPorphyromonas gingivalis誘発性歯周炎群の3つのグループに分けます。

FITC標識デキストランやロダミンB標識デキストランなど、重なり合わないスペクトルを持つ蛍光トレーサーを選択します。トレーサーを希釈するために、FD40とRD70をそれぞれ1グラム/リットルに2%カルボキシメチルセルロースゲルに混ぜます。準備した混合物は氷で保存してください。

足の指をつまむ反射で麻酔の深さを確認した後、マウスギャグを使って麻酔マウスの口腔を開け続けます。準備済みトレーサー混合物50マイクロリットルを臼歯部の唇歯肉表面に局所的に塗布します。混合液を30分間そのままにして、飲み込んだ場合は再度塗り直してください。

トレーサーを30分間塗ったら、ネズミを段ボールの上に仰向けに固定し、四肢をテープで固定して動物を動けなくします。次に、安楽死マウスの口腔を開け、上顎骨を隔離します。周囲の組織を優しく取り除き、PBSで標本をしっかりすすいでください。

孤立した上顎骨をガラススライドに置きます。次に、両面にモデリングクレイを敷いてカバースリップを安定させ、サンプルの上に固定します。解剖した上顎骨をカスタム設計のサンプルホルダーに慎重に配置し、画像撮影のために安定した位置を確保します。

25倍の水浸式対物レンズを備えた直立単一光子顕微鏡を使用。上顎骨の下に取り付けられた支持領域に焦点を合わせて画像を取得してください。上顎の第2大臼歯の頬面で関心のある部位を選択し、すぐに画像診断を開始します。

歯肉表面から100〜200マイクロメートルの深さまでのステップサイズでZスタック画像を取得し、三次元再構築を行います。ソフトウェア内で「ファイル」をクリックし、「新しいフォルダ」を選択してデータセットの新しいフォルダを作成し、説明名を割り当てます。取得タブでXYフォーマットを512×512、解像度0.99マイクロメートル/ピクセルに設定します。

次にズーム係数を1に設定します。次に励起波長を488ナノメートルと561ナノメートルに設定します。放射ウィンドウをそれぞれ500ナノメートルから550ナノメートル、570ナノメートルから620ナノメートルに設定します。

Zシリーズおよび三次元イメージングの場合は、ND取得モードを選択してください。Zステップを1マイクロメートルに設定し、必要に応じて調整してください。パラメータ設定後、ライブモードを選択して、個別および統合された蛍光チャネルで歯肉領域を可視化します。

次に「今すぐ実行」をクリックして画像取得を開始します。透過率を測定するために、FD40とRD70の蛍光強度を異なるチャネルに分けます。背景の減算なしでZ軸のスライスをマージします。

その後、ImageJソフトウェアを使って蛍光強度を定量化し、上皮バリアの透過性を評価します。ファイルをクリックして「開く」を選択して、ImageJで上顎の画像を開きます。次に画像を押し、画像タイプを解析用に8ビット形式に変更します。

「分析」をクリックし、セット測定値を選択します。次に面積、平均、積分密度を確認し、OKをクリックして確認してください。次に希望のチャンネルを選択し、画像をクリックして調整し、しきい値を調整します。

黒い背景を考慮して暗い背景オプションを有効にしてください。「分析」をクリックしてセット測定値を選択してください。次に、平均グレー値と閾値の制限を確認し、OKをクリックして確認してください。

フリーハンド選択ツールを使い、歯肉組織側の蛍光信号領域の輪郭を手動でなぞります。分析をクリックして測定を選択すると、積分密度が蛍光強度を表すことを示します。測定結果をスプレッドシートにコピーして計算やグラフ作成を行います。

スプレッドシート内の対照群の平均蛍光強度を計算します。各実験群の蛍光強度値を対照群平均値で割り、相対蛍光強度を得ます。対照群では、両方の蛍光トレーサーは主に歯肉表面に限定されていました。

結紮およびジンジバルポルフィロモナス治療群の両方で、FD40およびRD70の歯肉上皮への有意な漏出が観察されました。半定量解析により、連結群およびPorphyromonas gingivalis処理群においてFD40およびRD70の蛍光強度が有意に増加していることが示されました。3D画像診断により、連結群およびジングジバルポルフィロモナス治療群の歯肉血管周辺のトレーサー蛍光分布が対照群に比べてより広範かつ拡散していることが明らかになりました。

このプロトコルは、マウスの歯肉側バリアの透過性と完全性を定量化します。このプロトコルはマイクロCTと組み合わせてマルチモーダル画像解析を行うことができます。さらなる研究では、口腔疾患におけるバリア修復薬や分子メカニズムの探求が期待できます。