超分解能イメージングと共有管理:多重検出を伴う共焦点顕微鏡のプロトコル

私たちの研究は、従来の顕微鏡の回折限界を克服し、動的な細胞内構造を可視化するためのアクセス可能な超分解能イメージング法の開発に焦点を当てています。超分解能法は光毒性、複雑な操作、特殊な調製に直面しています。このプロトコルは、共焦点ベースの多重検出によってこれらの障壁を低減します。

まず、顕微鏡のメインユニット、レーザー発射モジュール、LED光源、制御コンピュータの電源を入れます。顕微鏡のオペレーティングソフトウェアを起動してください。メインインターフェースからGFPを選択し、反射光をオフにする選択をします。

取得パネルに移動します。対物レンズのドロップダウンメニューから、適切な対物レンズを選択します。生細胞イメージングの際、撮影の45〜60分前に環境チャンバーとアクティブフォーカス安定化システムを作動させます。

システムが安定化した後、チャンバーセンサーで安定性を確認します。泡を発生させずに対物レンズ前面のレンズに浸漬油を塗ります。準備済みのサンプルを顕微鏡ステージに置きます。

カバースリップが浸漬油に触れるまで慎重に持ち上げます。次に、取得ソフトウェアを開きます。取得タブに行き、「新しい実験を作成」を選択してください。

次に、使用された蛍光分子のイメージングトラックを追加します。各トラックごとに、共焦点ピンホールの直径を1つの空気ユニットに設定します。レーザー出力を最適化するには、最初のチャンネルを選択してライブスキャンモードに切り替えてください。

初期レーザー出力を低く設定し、検出器の利得を線形範囲内の適度なレベルに設定します。その後、レーザーの出力を徐々に上げて、ライブ画像の背景の上にターゲット構造がはっきり見えるまで続けます。ソフトウェアのナイキストサンプリングボタンでピクセルサイズを自動計算します。

次にピクセルタイムを設定します。次に、トラック間の逐次スキャンモードを選択してクロストークを最小限に抑えてください。「スナップ」をクリックすると、単一の画像を取得します。

関連するメタデータとともに画像を保存してください。光学セクション全体で一貫した設定を得るために、Zスタックを定義する前に、すべてのイメージングパラメータが単一の最適な焦点面上に設定されていることを確認しましょう。取得タブを開き、Zスタックモードを選択してください。

高速ライブスキャンでまず最下の関心構造にフォーカスし、次に「最後に設定」または「最下」をクリックして、関心の体積を定義します。注意深く焦点を最上部の興味のある構造に調整し、「Set First」または「Set First」をクリックします。ソフトウェアはその合計深度を表示します。

Zスタックのサイズはナイキストサンプリング基準を満たすように設定されます。最適ボタンを使って自動的に計算してください。各チャンネルのイメージングパラメータを設定した後、単一の二次元画像と比較して弱い信号に対してレーザー出力や利得をわずかに上げます。

画像スタック全体を収集するために取得を開始します。可視化には、顕微鏡のネイティブ処理モジュールを使いましょう。すべてのピント信号を単一の二次元画像で表示するための最大強度投影を生成します。

その後、ソフトウェア内蔵のアルゴリズムを使って体積レンダリングを行い、三次元表現を生成します。明るさ、不透明度、照明は必要に応じて調整してください。その後、直交するXZおよびYZ断面図を作成し、軸方向の広がりと位置合わせを検査します。

固定されたCOS-7細胞の多色蛍光画像診断では、核、ミトコンドリア、微小管が重なりが最小限で明確に標識されており、効果的な逐次スキャンと最適化された検出が確認されました。最大強度投影はすべての光学断面に信号を統合し、蛍光標識構造の空間的分布を強調します。三次元再構成により、サンプルアーキテクチャの奥行き認識的なビューが得られます。

EGFPタグ付きミトコンドリアを持つ3B肝炎の生細胞のタイムラプス画像診断を各モードで比較しています。時間点をまたぐ共焦点フレームは明確な構造を示しますが、信号は徐々に失われていきます。標準的な超解像度(SR)フレームは解像度が高いものの、時間とともに光漂白が増加します。

高速超分解能やSR-4Y画像は、より遅い時間点でも安定した蛍光を保ちます。100時間点にわたる平均EGFP蛍光強度のグラフは、SR-4Yモードが最も安定した信号を維持していることを示しています。固定されたCOS-7セルでのイメージング性能はモード間で比較され、超分解能モードは共焦点モードよりも構造的詳細が鮮明で提供されました。

100ナノメートル蛍光ビーズを用いて点拡散関数を測定したところ、AiryscanのSRとその後のジョイントデコンボリューションは、Airyscan単独のSRと比較して横方向および軸方向の解像度を向上させました。このプロトコルにより、研究者は固定細胞および生細胞の両方において、細胞小器官の形態、細胞骨格動態、分子共局在を約120ナノメートルの解像度で研究できます。このプロトコルで最も重要な考慮点は、高品質なカバーガラスと最適化された染色を用いた綿密なサンプル準備で、超分解能処理のための信号の完全性を確保することです。

この手順に従い、研究者はImageJのような専用ソフトウェアを用いて、信号対雑音比や共局在在の測定などの定量的な画像解析を行うことができます。