マウス海馬における厚組織のクライオ電子断層撮影ワークフロー
2026年3月27日
このプロトコルは、高圧凍結(HPF)とワッフル法、低温集束イオンビーム(cryo-FIB)リフトアウト、線量対称の並列取得を統合することで、厚組織のクライオ電子断層撮影(cryo-ET)を標準化し、マウス海馬での再現可能な 現地 解析のための均一な薄い板状およびガラス化標本を得ています。
私の研究は、マウスの海馬のような厚い組織の現地構造解析を可能にする標準化されたクライオETワークフローの確立に焦点を当てています。既存の手法では厚組織の信頼性が低いため、このプロトコルは標準化された解析のために最適化されたステップを統合しています。まず、10%ショ糖溶液の10リットルの液滴をきれいなガラス面に置きます。
安楽死したばかりのマウスの海馬を素早く解剖します。鋭いカミソリの刃を使って、0.5〜1立方ミリメートルの小さな組織片を切除します。爪楊枝や細かいブラシを使い、組織を高圧凍結キャリア内の準備された銅支持TEMグリッドに移します。
2-メチルペンタンを使って組織を湿らせ、グリッド上の位置を調整しつつ、機械的ストレスを最小限に抑えてグリッド損傷を防ぎます。次に、組織とグリッドを直径3ミリの銅箔ディスクで覆います。組み立てを完成させるために、2つ目の高圧冷凍キャリアを平らな面を下に置いて密封されたワッフルサンドイッチを作ります。
そして、機器に異常がないか凍結パラメータも確認してください。組織剥離から凍結までの合計時間が90秒を超えないようにしてください。リフトアウト手順の最終受信グリッドとして使える新しい300メッシュのゴールドグリッドを入手してください。
室温の立体顕微鏡下で、グリッドを優しくクリップで対応するクライオFIBオートグリッドリングにクリップします。その後、組み立てたオートグリッドを約40度の温度で乾燥オーブンに直接保管し、使用前に霜の蓄積を最小限に抑えます。組み立て物を液体窒素に浸しながら、ガラス化TEMグリッドを周囲のワッフル組立部品から慎重に分離してください。
冷えた細かいピンセットを使って、高圧冷凍キャリア2本を優しくこじ開けます。次に、予冷されたクライオローディングワークステーション上で、分離組織グリッドを液体窒素の保護のもと、2つ目のクライオFIBオートグリッドリングに取り付けます。両方のオートグリッドをクライオトランスファーシャトルサンプルホルダーの指定スロットに装填してください。
各オートグリッドをミリングノッチが外向きにし、垂直に配置してミリング角度を低くするように配置してください。満載シャトルは液体窒素に浸すか、FIB-SEMに移されるまで予備冷却状態に保たれます。サンプルロッドを使ってサンプルステージを機器にロードします。
顕微鏡へのクリオ転送後、低SEM倍率で組織グリッドに移動します。その後、30ミリアンペアで15秒間プラチナをスパッターコーティングして導電性保護を行います。ガス注入システムを用いて、厚さ0.5〜1.0マイクロメートルの有機金属プラチナキャップを約60秒間堆積します。
グリッド表面に30ミリアンペアで15秒間、スパッターコーティングされたプラチナ層を塗布します。SEM電子ビーム画像を使い、組織グリッド上で選ばれた関心領域へ移動します。前面ミリング用の試料の向きを決めるには、ステージを約110度回転、7度傾けて、イオンビームアクセスに適した角度で試料表面を提示します。
トレンチミリングでは、30キロボルトで動作するイオンビームを用いて、ターゲット組織ブロックを囲む長方形のトレンチを定義します。ブロックから離れた場所で比較的高い電流(15ナノアンペア)を使い、迅速な材料除去を実現します。溝壁がブロックに数マイクロメートル以内に近づくと、イオンビーム電流を7ナノアンペアに下げて、より精密なフライス制御を実現します。
ブロックの片側をバルク素材に取り付けて一時的な固定タブを作りましょう。推定厚さ20マイクロメートルを超える組織ブロックについては、最終リフトアウトを容易にするために裏側からアンダーカットミリングステップを行います。ステージを回転させ、傾斜を調整してブロックの底に触れます。
30キロボルト、3ナノアンペア電流で集光イオンビームを使い、裏側の接続部を研磨します。金属ブロックの底をサンプルブロックにぴったりと合わせるように加工します。試料と金ブロックの接触面を精密に粉砕し、接点をより密にします。
サンプルを針に取り付ける際は、金ブロックがターゲットサンプルに直接接触していることを確認してください。30キロボルト、0.5ナノアンペアの集束イオンビームを用いて、界面で8〜12回の連続断面ミリングパターンを行い、金ブロックを試料に溶接します。組織ブロックを持ち出すには、集束イオンビームを使ってブロックとバルクサンプルをつなぐ残りのタブを切断します。
マイクロマニピュレーターの針を慎重に動かし、孤立した組織ブロックを溝や周囲のグリッドから完全に持ち上げます。針を引っ込めてブロックを受信グリッドに運びます。マイクロマニピュレーターの針を操作し、予冷された300メッシュのゴールド受信グリッドへ誘導します。
ブロックを選んだグリッドマスに下ろします。グリッド上の小さな氷結晶を粉砕して、組織ブロックとグリッドの密着性を高めましょう。組織ブロックをグリッドに接触させるように下げてください。
イオンビームを使ってブロックから3〜4マイクロメートルの厚さのスライスをグリッドフィルムに粉砕します。次に、接合部の両側にクリーニング断面パターンを用いてフライスリングでスライスを確実に溶接し、前述のように導電性および保護性コーティングをグリッド面に再度塗布します。ラメラ薄化では、ステージチルトを設定した後、組織ブロックの滑らかな領域内でラメラの最終位置を定義します。
表に示されたイオンビーム電流とオーバーチルト補償を用いて体系的なミリングを行います。ラメラから1〜2マイクロメートル以内であれば、必要に応じて約1.5マイクロメートル離れた場所に応力緩和トレンチをミルしてラメラの曲がりや巻きつきを防ぎます。ラメラ準備後、クライオ電子顕微鏡で画像を取得します。
ワッフル法で高圧冷凍処理された組織ブロックは均一で電子透明な外観を示しました。再構築されたトモグラムにより、細胞環境内のミトコンドリア構造が解明されました。リボソームのような高分子複合体は細胞質内で明確に分離されていました。
再構築されたトモグラムでは、細胞骨格および膜に関連する細胞の特徴や核孔複合体も確認されました。トモグラムでは、カルシウム貯蔵やミエリン鞘構造を含むシナプス構造や特徴が明確に確認されました。このプロトコルにより、研究者は複雑な組織環境内で直接、ネイティブな細胞外殻構造を研究することが可能になります。
このクライオETプロトコルで最も重要な課題は、厚い組織サンプルの均一でアーティファクトのないガラス化を達成することです。この手順の後、研究者は相関光顕微鏡や電子顕微鏡、または標識技術を用いて関心領域を特定し、サブトモグラム平均化および構造解析を行い、高分子錯体を分解できます。
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Overview
This article presents a comprehensive, standardized workflow for cryo-electron tomography (cryo-ET) of thick tissue samples, specifically demonstrated on mouse hippocampus. The protocol integrates rapid high-pressure freezing, precise cryo-focused ion beam (cryo-FIB) milling, and advanced imaging and data processing steps to enable high-resolution, in situ structural analysis of native cellular environments within complex tissues.
Key Study Components
Area of Science
- Structural biology
- Cryo-electron microscopy
- Tissue ultrastructure analysis
Background
- Cryo-ET allows 3D visualization of cellular ultrastructure in a near-native state.
- Application to thick tissues is limited by challenges in vitrification and lamella preparation.
- Existing protocols often lack reproducibility and throughput for complex tissue samples.
- Reliable workflows are needed for in situ analysis of macromolecular complexes within tissues.
Purpose of Study
- To establish a reproducible, end-to-end cryo-ET workflow for thick tissue samples.
- To optimize vitrification and lamella preparation for high-quality imaging.
- To enable high-throughput, artifact-free structural analysis of native tissue environments.
Methods Used
- Rapid dissection and high-pressure freezing (HPF) of tissue using a "waffle" assembly with copper foil.
- Transfer and mounting of tissue onto TEM grids, followed by vitrification within 90 seconds of dissection.
- Cryo-FIB milling for lift-out and thinning of tissue blocks to 120–200 nm lamellae, with over-tilt compensation and stress-relief trenching.
- Standardized conductive coating using sputter platinum and gas injection system (GIS) platinum cap.
- Automated, dose-symmetric tilt-series acquisition using PACEtomo scripts.
- Data processing with AreTomo 3 for motion correction, CTF estimation, alignment, and WBP reconstruction; optional IsoNet for missing-wedge correction.
- Subtomogram averaging and resolution assessment using RELION 4.0.
Main Results
- The workflow consistently produces well-vitrified, uniform lamellae (target thickness 150 ± 40 nm).
- High-throughput tilt-series collection is achieved (typically 5–8 minutes per tilt series).
- Reconstructed tomograms resolve key cellular structures, including mitochondria, ribosomes, cytoskeletal elements, nuclear pore complexes, synaptic features, calcium stores, and myelin sheaths.
- The protocol enables direct visualization and analysis of macromolecular complexes in situ within thick tissue samples.
Conclusions
- This standardized protocol overcomes major challenges in cryo-ET of thick tissues, particularly vitrification and lamella preparation.
- It provides a reproducible, high-throughput route for in situ structural biology studies in complex tissue environments.
- The workflow facilitates detailed analysis of native cellular architecture and macromolecular assemblies directly from tissue.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
High-resolution, in situ structural analysis of thick tissue samples is a critical bottleneck in early discovery and translational research. This standardized cryo-electron tomography (cryo-ET) workflow enables reproducible, artifact-minimized visualization of native cellular architecture directly from complex tissues, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The protocol's throughput and reliability position it as a foundational capability for enterprise-scale structural biology and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of macromolecular complexes within native tissue environments.
- Supports mechanistic de-risking by resolving cellular ultrastructure relevant to disease pathways.
- Facilitates functional target validation through high-fidelity visualization of subcellular features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by minimizing sample preparation artifacts.
Screening & Assay Development
- Prepares uniform, electron-transparent lamellae suitable for downstream high-throughput imaging workflows.
- Standardizes sample preparation to ensure reproducibility and quantitative comparability across experiments.
- Enables reliable assessment of compound effects on tissue ultrastructure in screening campaigns.
- Supports platform scalability and reuse for diverse tissue types with minimal adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural readouts with disease-relevant tissue models for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical validation in complex tissues.
- Reduces risk of late-stage biological failure by enabling early detection of ultrastructural phenotypes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on direct visualization of target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling robust, high-throughput structural analysis of thick tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct visualization of native macromolecular assemblies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative lamellae preparation for reliable downstream imaging and analysis.
- Analytics: Provides high-resolution tomograms and subtomogram averages for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease-relevant model validation using in situ tissue architecture.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized protocol adaptable across tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable sample preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM, cryo-FIB milling, and high-pressure freezing instrumentation.
- Demands access to advanced analytical infrastructure for automated tilt-series acquisition and data processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, vitrification, and lamella preparation protocols.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of dissection and freezing parameters.
- Uniform vitrification and artifact minimization are critical for reproducible, high-quality outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
High-Pressure Freezing of Thick Tissue for Cryo-Electron Tomography
1:44
Preparation of Receiver and Tissue Grids for Cryo-FIB Lift-Out
4:08
Tissue Block Isolation and Lift-Out
6:56
Block Attachment to the Receiver Grid
7:49
Lamella Thinning
8:36
Results
9:23
Conclusion
