ナノ孔シーケンシングを用いたロングリードプラズミドシーケンシングおよびアセンブリ ワークフロー
July 7th, 2026
本研究では、染色体配列が既に知られている場合や興味がない場合のプラスミドのナノ孔シーケンシングのワークフローを記述しています。初期のプラスミドDNA濃縮ステップは、最適なプラスミド配列深度を確保し、フローセルあたりのシーケンス可能なサンプル数を最大化します。
我々は、プラスミドとして知られる自己複製性環状DNAエレメントの複製、維持、および普及を調査します。これには、それらの配列の決定が必要です。このプロトコルは、長鎖シーケンシングに関連するカバレッジと精度の問題に対処し、プラスミドDNAを濃縮し、組み立て方法を最適化します。当社のプロトコルは、染色体配列が既知または無関係な状況でプラスミドをシーケンスするように設計されています。
まず、LBアガープレートにサンプルを塗り、適切な抗生物質を添加して、対応するプラスミド由来の耐性マーカーを選択します。プレートを37度セルシウスで24時間インキュベートします。翌日、単離されたコロニー1つで3〜5ミリリットルのLB培地を適切な抗生物質で補充し、接種します。
培養液を37度セルシウスで振とうしながら約8時間、または光密度（600ナノメートル）が1〜2になるまでインキュベートします。次に、400マイクロリットルのスターター培養物を400ミリリットルのLB培地に接種し、適切な抗生物質で補充し、先ほどと同様にインキュベートします。その後、培養液を培養容積に適した遠心分離管に移します。
4,200Gで10分間遠心分離し、メーカー推奨の試薬量を使用してペレットを再懸濁します。細胞溶解および中和の後、4,200Gで30分間溶解物を遠心分離します。上清を新しいチューブに移し、再度遠心分離します。
メーカーの指示に従って平衡、洗浄、DNA溶出を行います。次に、ナノポアライブラリ調製のために濃度を最大化するために、100マイクロリットルの核酸分解酵素フリー水で沈殿したDNAを再懸濁します。次に、DNAを定量するために、提示された表に従ってアッセイトーブを準備します。
フルオロメーターを調整した後、サンプルチューブをフルオロメーターに挿入し、機器マニュアルに従って読み取りを記録します。熱サイクラーを30度セルシウスで2分、80度セルシウスで2分にプログラムします。提示された表に従って、溶解したキット成分をスピニングして混合します。
バーコーディング用に準備したPCRチューブを熱サイクラープログラムでインキュベートします。次に、チューブを氷上で冷却します。バーコード付きサンプルを1.5ミリリットルの清浄なエッペンドルフチューブにプールし、総量が1,000マイクロリットルを超えないようにします。
ビーズを渦巻き状に混合した後、プールしたバーコード付きサンプルに同量のビーズを加えます。チューブをフリックして混合し、10分間インキュベートします。次に、マグネット上でビーズを80%エタノール1ミリリットルで洗浄します。
エタノールを除去し、もう一度繰り返します。チューブをマグネットから取り外します。使用しているバーコードの数に基づいて適切な量の溶出バッファーでビーズを再懸濁し、室温で10分間インキュベートします。
溶出されたサンプルの1マイクロリットルを使用してフルオロメーターでDNA濃度を定量し、成功したライブラリ調製を確認します。アダプター結合のために、DNAライブラリの11マイクロリットルを新しいチューブに移し、ラベルを付けます。次に、新鮮なチューブで提示された成分を混合して、溶解したラピッドアダプターを希釈します。
次に、11マイクロリットルのDNAライブラリに1マイクロリットルの希釈したラピッドアダプターを加え、チューブをフリックして内容物を混合します。チューブを短時間スピニングして、完全な量が底に集まるようにし、ベンチで5分間チューブをインキュベートします。新鮮なDNAチューブでフローセルのプライミングミックスを準備し、反転とピペッティングで混合します。
デバイスの蓋を持ち上げ、フローセルを適切に配置されるよう穏やかに圧力をかけながら挿入します。プライミングポート内またはその隣に気泡がないか確認した後、20〜30マイクロリットルの液体を引き戻して気泡を除去します。次に、800マイクロリットルのプライミングミックスをプライミングポートに注入し、気泡を避けつつ、デバイスを5分間放置します。
ここで提示されているように、新しいチューブでDNAライブラリを適切な量のライブラリビーズと混合します。フローセルのプライミングポートに200マイクロリットルのプライミングミックスをロードします。サンプルポートカバーを調整してポートを露出させます。
ビーズを含むDNAライブラリの75マイクロリットルを一滴ずつサンプルポートに注入し、各滴が吸収されるまで待ってから次の滴を加えます。次にサンプルポートカバーを再度装着し、プライミングポートを閉じます。デバイスの蓋が閉じたら、シーケンス実行を開始します。
使用するプラスミドの数に基づいて実行時間制限を設定し、デフォルトで48時間、最大72時間とします。スーパー正確な塩基呼び出しモードと適切なラピッドバーコードキットオプションを選択します。次に、生のFAST5またはPOD5データを選択し、塩基呼び出しを開始します。
ダウンストリームアセンブリ用のフィルタ付きFASTQファイルを生成するために、Filtlongを使用して長い読み取りをトリミングし、最低品質の読み取りの約5〜10%を削除し、合計の約90%を保持します。推奨設定に従ってAutocyclerを使用して読み取りをサブサンプリングします。Raven、Flye、Kanu、Miniasm、Myloasm、NECAT、Plassembler、およびその他の選択したアセンブラを使用して各読み取りサブセットをアセンブルします。
bandageを使用して各アセンブリグラフファイルを視覚化します。アセンブラ間での環状性、サイズの一貫性、キメラ接合の証拠についてコンティグを評価します。複数のアセンブラ間でサポートされていない直線状コンティグを削除し、一貫したサイズ推定値を持つ環状コンティグを保持します。
主要なプラスミドが環状化される前に、主要なプラスミドが環状化される前に、マイナーなサポートされていないコンティグを削除します。手動キュレーションの後にコンセンサス生成に進みます。キュレーションされたアセンブリを使用してAutocyclerでコンセンサス配列を生成します。
残りのAutocyclerコマンドを実行して最終的なコンセンサスプラスミド配列を生成します。最後に、Medakaを使用してトリミングされた長い読み取りで最終的なアセンブリを磨き、コンセンサスの精度を向上させます。すべての接合アッセイはトランスコンジュガンを生成し、ドナーに接合プラスミドの存在を確認しました。
組み立てられたプラスミド配列のサイズは、パルスフィールドゲル電気泳動の移動度に基づく推定値と一致していました。ナノポアシーケンシングは、分析されたすべてのサンプルで十分な読み取り出力と品質を生成しました。染色体汚染率は72.1%から28.0%の範囲で平均46.9%でした。UPEC_271株のプラスミドのパルスフィールドゲル電気泳動分析は、約145キロベースペアのプラスミドに対応するバンドを明らかにしました。
Overview
This article presents a detailed workflow for nanopore sequencing aimed at maximizing plasmid DNA yield and sequencing accuracy. The protocol encompasses plasmid extraction, rapid barcoding, adapter ligation, sequencing, and sequence assembly, and is suitable for a wide range of plasmid sizes and levels of chromosomal contamination. The method is demonstrated using Escherichia coli as a model organism.
Key Study Components
Area of Science
- Molecular biology
- Genomics
- Microbiology
Background
- Plasmid sequencing is essential for genetic studies, recombinant gene expression, and plasmid capture experiments.
- Traditional sequencing methods may be limited by chromosomal contamination and low plasmid yield.
- Nanopore sequencing offers long-read capabilities and real-time data acquisition.
- Efficient workflows are needed to optimize plasmid sequencing throughput and accuracy.
Purpose of Study
- To develop and describe a robust workflow for nanopore-based plasmid sequencing.
- To maximize plasmid DNA yield and sequencing accuracy.
- To enable efficient parallel sequencing of multiple samples.
Methods Used
- Plasmid DNA extraction from clinical E. coli strains.
- Library preparation using rapid barcoding and adapter ligation.
- Loading libraries onto a nanopore flow cell for sequencing.
- Base calling performed in real time or post-hoc.
- Sequence assembly using Autocycler.
- Comparison of assemblies to gel mobility and short-read polished assemblies.
Main Results
- Plasmid assemblies matched sizes inferred from gel mobility.
- In two-thirds of cases, assemblies matched or closely resembled short-read polished assemblies (within 0.05% pairwise identity).
- Protocol supports plasmids from 4 to 174 kb in size.
- Up to 72% chromosomal contamination tolerated without loss of accuracy.
- Parallel sequencing of up to 24 samples achieved with optimal coverage.
Conclusions
- The workflow enables accurate and efficient plasmid sequencing using nanopore technology.
- It is suitable for plasmid verification, improving WGS-derived plasmid sequences, and sequencing plasmids captured by conjugation.
- The protocol is robust to chromosomal contamination and applicable to a range of plasmid sizes.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Long-read nanopore plasmid sequencing enables high-confidence verification and assembly of plasmid constructs, supporting critical quality control and mechanistic de-risking in biopharma R&D. This workflow addresses the challenge of chromosomal contamination and variable plasmid yield, providing robust, scalable solutions for recombinant DNA and gene therapy vector development. Its parallelization and tolerance for mixed DNA inputs streamline early discovery and preclinical workflows, enhancing portfolio decision-making.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise verification of engineered plasmids for functional studies and target validation.
- Reduces ambiguity in construct identity, supporting mechanistic de-risking in discovery biology.
- Facilitates rapid triage of candidate constructs for downstream screening or expression.
Screening & Assay Development
- Provides validated sequence data for assay-ready plasmids, ensuring reproducibility in screening campaigns.
- Supports parallel sequencing of up to 24 samples, increasing throughput for construct libraries.
- Delivers quantitative sequence accuracy, enabling reliable comparison across engineered variants.
Translational & Preclinical Research
- Improves continuity from discovery to preclinical studies by confirming plasmid integrity in disease-relevant systems.
- Enables sequence verification for plasmids used in gene delivery or biomarker studies.
- Supports risk-adjusted advancement by minimizing sequence-related uncertainties in preclinical models.
Pipeline & Workflow Integration
This nanopore-based workflow integrates from early construct verification through screening and preclinical validation, supporting both hypothesis-driven and translational research pipelines.
- Discovery Biology: Confirms plasmid sequence fidelity, reducing risk of off-target effects in functional assays.
- Screening: Ensures assay-ready constructs are sequence-verified, supporting reproducible compound evaluation.
- Analytics: Provides high-accuracy, quantitative sequence data for cross-sample comparison and quality control.
- Translational Research: Aligns plasmid sequence verification with preclinical model requirements for gene expression studies.
- Enterprise Reuse: Offers a scalable, parallelizable sequencing capability adaptable across diverse R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in construct-driven studies and reduces mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardizes plasmid verification, tolerates high chromosomal contamination, and supports high-throughput workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by ensuring construct integrity before downstream investment.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene-based assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plasmid extraction, library preparation, and nanopore sequencing workflows.
- Demands computational infrastructure scaled to real-time or post-hoc basecalling needs.
- Benefits from standardized protocols for cross-team reproducibility and data comparability.
- Adaptable to a range of plasmid sizes and host backgrounds, including high chromosomal DNA content.
- Best suited for applications where chromosomal sequence is known or not required.
