ナノ孔シーケンシングを用いたロングリードプラズミドシーケンシングおよびアセンブリ ワークフロー

私たちは、自己複製する環状DNA元素であるプラスミドの複製、維持、伝達を調査しており、その配列の決定を必要とします。このプロトコルは、プラスミドDNAの濃縮と組み立て方法の最適化を通じて、ロングリードシーケンスに伴うカバレッジおよび精度の問題に対応します。私たちのプロトコルは、染色体配列が既知または無関係な状況でプラスミドをシーケンスすることを目的としています。

まず、適切な抗生物質を添加したLBオーガープレートにサンプルをストリークし、それぞれのプラスミド伝媒耐性マーカーを選択します。プレートは37度Cで24時間孵化します。翌日、適切な抗生物質を補足したLB培地を3〜5ミリリットル接種し、単一単離コロニーを接種します。

培養を37度の温度で約8時間、または600ナノメートルの光学密度が1〜2に達するまで培養します。次に、LB培地400ミリリットルに適切な抗生物質を補足し、スターター培養液400マイクロリットルを接種し、先に示した通りに培養します。その後、培養液を培養体積に適した遠心分離機のボトルに移します。

4、200Gで遠心分離機で10分間加熱し、メーカーが推奨する試薬量でペレットを再懸浮させます。細胞溶解と中和の後、溶解液を4,200 Gで30分間遠心分離します。上清液を新しいチューブに移し、再度遠心分離機で処理します。

メーカーの指示に従って平衡、洗浄、DNA洗出を行います。その後、沈殿したDNAをヌクレアーゼフリー水100マイクロリットルに再懸濁させ、ナノ孔ライブラリーの準備に最大限の濃度を上げます。次にDNAを定量するために、示された表に従ってアッセイチューブを準備します。

蛍光計の校正後、試料チューブを蛍光計に挿入し、機器のマニュアルに従って測定値を記録します。サーマルサイクラーを30度に2分間、続いて80度に2分間設定します。解凍したキットの部品を、提示された表に従って回して混ぜます。

バーコード用に準備されたPCRチューブはサーマルサイクラープログラムを用いて培養します。その後、チューブを氷の上に置いて冷ます。バーコード化されたサンプルを、1.5ミリリットルのエッペンドルフ管にまとめ、総体積が1,000マイクロリットルを超えないようにします。

ビーズが渦巻き終わったら、同じ量のビーズをプールしたバーコードサンプルに加えます。チューブをはじいて混ぜ、その後10分間の孵化を行います。その後、マグネットに当てて80%エタノールを1ミリリットルで洗います。

エタノールを除去して、これを一度繰り返します。チューブを磁石から外してください。使用するバーコードの数に応じて適切な体積でビーズを洗脱バッファーに再懸浮させ、室温で10分間インキュベーションします。

検出されたサンプルの1マイクロリットルを用いてフルオロメーターでDNA濃度を定量し、ライブラリーの調製が成功したことを確認します。アダプターライゲーションでは、DNAライブラリー11マイクロリットルを新しいチューブに移し、標識を付けます。次に、提示された部品を新しいチューブで混ぜて、解凍したラピッドアダプターを希釈します。

次に、11マイクロリットルのDNAライブラリーに薄めたラピッドアダプター1マイクロリットルを加え、チューブをはじいて内容物を混ぜます。チューブを少し回転させて全体の容量が底に集まるようにし、ベンチの上で5分間孵化させます。フローセルプライミングミックスを新しいDNAチューブで準備し、逆位とピペッティングで混合します。

装置の蓋を持ち上げ、フローセルを挿入しながら、適切な配置を確保するために優しく圧力をかけます。プライミングポート内またはその隣接に気泡がないか確認した後、20〜30マイクロリットルの液体を吸い戻して気泡を取り除きます。その後、800マイクロリットルのプライミングミックスを抽出し、気泡を避けながらプライミングポートに注ぎ、デバイスを5分間放置します。

ここで示した通り、DNAライブラリーと適切な量のライブラリービーズを新しいチューブで混ぜます。200マイクロリットルのプライミングミックスをフローセルのプライミングポートに注入します。サンプルポートのカバーを調整してポートを露出させます。

75マイクロリットルのDNAライブラリーとビーズを1滴ずつサンプルポートに注ぎ、各滴が吸収されるまで次の滴を加えます。その後、サンプルポートのカバーを再度貼り付け、プライミングポートを閉じます。装置の蓋が閉じたら、シーケンスランを開始します。

マルチプレックスされるプラスミドの数に基づいて実行時間の制限を設定し、デフォルトは48時間、最大72時間です。超高精度のベースコールモードと適切なラピッドバーコードキットオプションを選択してください。次に、生のFAST5またはPOD5データを選択してベース呼び出しを開始します。

下流アセンブリ用のフィルタリング済みFASTQファイルを生成するには、Filtlongを使って長リードをトリミングし、約5〜10%の低品質リードを除去しつつ、全体の約90%の収量を保持します。サブサンプルは推奨設定に従ってAutocyclerで読みます。Raven、Flye、Kanu、Miniasm、Myloasm、NECAT、Plassembler、その他の選択されたアセンブラを使って各リードサブセットを組み立てます。

各アセンブリグラフファイルを包囲布で視覚化してください。円形の形成、アセンブラー間のサイズ一貫性、キメラ節理の証拠を評価する。複数のアセンブラでサポートが不足している線形コンティグを削除し、一貫したサイズ推定で円形コンティグを保持します。

主要なプラスミドが円形化される際に合意生成前に、支持されない小規模なコンティグを除去してください。手動キュレーション後にコンセンサス生成に進みます。Autocyclerを使ってキュレーションされたアセンブリでコンセンサスシーケンスを生成します。

残りのオートサイクラーコマンドを実行し、最終的なコンセンサスプラスミド配列を作成してください。最後に、メダカでトリミングロングリードを使って最終アセンブリを磨き、合意の正確性を高めましょう。すべての接合アッセイでトランスコンジャガントが認められ、ドナーに共役プラスミドの存在が確認されました。

組み立てられたプラスミド配列のサイズは、パルスフィールドのゲル電気泳動移動度に基づく推定値と一致していました。ナノ孔シーケンシングにより、解析されたすべてのサンプルに対して十分なリード出力と品質が得られました。染色体汚染率は72.1%から28.0%の間で、平均46.9%でした。ひずみプラスミドUPEC_271のパルスフィールドゲル電気泳動解析では、約145キロ塩基ペアのプラスミドに対応するバンドが明らかになりました。

トランスコンジャガントの一つのDNAは145キロベースと同一の配列を示しました。スパルスフィールドゲル電気泳動によるストレイン血液100913解析により、約70キロ塩基対および110キロ塩基対の2つのプラスミドが同定されました。ナノポアシーケンシングにより、71,182塩基対と111,226塩基対の2つのプラスミドアセンブリが確認されました。

最も重要な考慮点は染色体配列が関心があるかどうかです。もしそうなら、標準的な全ゲノムシーケンシングプロトコルの方が優れています。私たちのプロトコルのカバー範囲拡大は、異質形成の研究への扉を開きます。すなわち、

特定の集団内でのプラスミド配列変異。