大 腸菌 および哺乳類細胞における遺伝コード拡張による部位特異的リジンラクチル化

私たちは、模倣や酵素の限界を克服するためにクロック/RSのtRNAシステムを開発し、リジンラクチル化の精密な組み込みを可能にしてその生物学的研究を可能にしました。このプロトコルは腫瘍代謝、酵素機能、時計部位の研究に応用可能です。まず、大腸菌DH10Bの化学的に適合した細胞50マイクロリットルと、それぞれ約100ナノグラムの目的プラスミドを共転換します。変換混合物を氷上で25分間孵育し、その後42度の温度で45秒間熱ショックをかけます。

チューブを3分間氷に戻してください。ルリア・ベルターニ培地を350マイクロリットル加え、チューブを毎分220回転で37度の温度で1時間激しく振る。次に、形質転換した細胞培養液をアンピシリンとクロランフェニコールを補足したルリア・ベルタニ寒天プレートに広げます。

プレートは37度の温度で12〜16時間孵化します。次に、プレートから単一のコロニーを選び、4ミリリットルのスターター培養液に接種し、一晩培養します。翌日、アンピシリンとクロランフェニコールを含むルリア・ベルタニ培地400ミリリットルに一晩培養を拡大します。

培養液を毎分220回転、37度の温度で激しく振って、600ナノメートルの光学密度が0.6から0.8の間で上昇するまで続けます。次に0.2%L-アラビノースと1ミリモラーラクチルリジンを誘導し、30度摂氏、220回転毎分で16時間培養します。種子細胞は12ウェルのプレートで、密度は1×10の5細胞の乗数で、1ミリリットルのDMEMを使用します。

細胞コンフルエンシーが70〜80%に達するまで24時間インキュベートし、その後トランスフェクションに進みます。希釈されたDNA溶液を準備するために、sfGFPリポーターおよびpNeu-KlacRSを含むプラスミド0.75マイクログラムを1対1の比率で、高グルコースの血清フリーDMEM38マイクロリットルに添加します。ピペットを上下に優しく動かしたり、短く渦巻きて混ぜます。

希釈したトランスフェクション試薬を製製するには、38マイクロリットルの高グルコースの血清フリーDMEMに2.25マイクロリットルのトランスフェクション試薬を加えます。ピペットを優しく上下に3〜4回繰り返して、しっかりと混ぜます。すぐに希釈したトランスフェクション試薬を希釈したDNA溶液に一度に加えます。

次にピペットで3〜4回上下に動かし、内容物を混ぜて室温で10〜15分間培養し、トランスフェクションとDNA複合体が形成されるのを待ちます。各ウェルにトランスフェクションおよびDNA複合体を50マイクロリットルずつドロップごとに培地に加え、プレートを優しく渦巻き合わせて混合物を均質化します。トランスフェクションから6時間後、培地を1ミリモララクチルリジンを含む新しいDMEMに置き換え、細胞を24〜48時間培養します。

大腸菌では、1ミリモラーラクチルリジンを培養培地に加えることで全長のhENO1-89Klacが生成されました。免疫ブロッティングにより、anti-Hisタグおよび抗L-ラクチルリジン抗体を用いて全長hENO1-89Klacの存在が確認されました。飛行質量分析のエレクトロスプレーイオン化時間では、48,178ダルトンの支配的なピークが示され、開始メチオニンを欠いたhENO1-89Klacの期待質量と一致しました。

トリプティック消化のタンデム質量分析法により、残基89におけるKlacのサイト特異的組み込みが、修飾ペプチドにマッピングされた完全なB&Yイオン系列の存在によって確認されました。哺乳類HEK293T細胞では、Klacを24時間および48時間添加した際、蛍光顕微鏡で細胞全体で強いsfGFP発現が認められましたが、Klac補給なしでは蛍光は観察されませんでした。フローサイトメトリーの結果、約31%の細胞が24時間後にsfGFPを発現し、Klac補給後48時間後には約37%に増加することが明らかになりました。

このプロトコルは、部位特異的なリジンラクチル化がタンパク質機能に与える影響の調査を可能にし、その結果としての生物学的および機能的アウトカムの測定を促進します。この手順の後、研究者は機構解析を行い、高スループットスクリーニングアッセイを実施し、安定した細胞株を生成して長期的な機能分析が可能です。今後の研究は、効率の向上、安定した統合の実現、クロック生合成の発展を目指しています。