頭部および脳からのリンパ輸送を評価する頸部リンパ管カニューレドラットモデル

私たちのプロジェクトでは、脳リンパがアルツハイマー病、脳卒中、神経炎症などの中枢神経系疾患とどのように関連しているかを調査し、脳から排出される物質を特定します。既存の手法には、このプロトコルによって可能となるCNS由来リンパ流出を理論的にサンプル化・定量化するプロトコルや信頼性の高いアプローチが不足していました。まず、約0.7ミリリットルの希釈抗凝固剤溶液を、ポリエチレンカニューレ内側をコーティングするための30ゲージ針付きの1ミリリットル無菌インスリン注射器に予備充填します。

使用までプリロードされた注射器は無菌状態で保管してください。カニューレの準備には、両端部に外径0.5mm、内径0.3mmのチューブ、中間部に外径0.6mmおよび内径0.5mmのチューブを使用します。ハサミを使って、注射器の針に接続する近位部のカニューレ区間を2センチメートル、中央部が40センチメートル、カニュレーション用の遠位部が8センチメートルの長さにカットします。

カニューレを頭から尾まで組み立てます。次に、カニューレの遠位端を約45度の角度で切り、面取りして頸部リンパ管へのスムーズな挿入を促します。組み立てたカニューレの近位端にあらかじめ注入された注射器を接続して、各カニューレの通行性を確認します。

少量の溶液を優しく抽出してカニューレを洗い流します。溶液が遠位端から漏れの証拠なくスムーズに排出されるようにしてください。麻酔をかけたラットを37度の温度で維持した加熱された手術用パッドの上に仰向けに置きます。

必要に応じて、小さなサポートピローを使って頭を傾け、首を伸ばして頸部の露出を増やします。前肢はゴムバンドや手術用テープで優しく拘束し、動きを最小限に抑えてください。頸部の毛は無菌生理食塩水で洗い流し、剃りやすくします。

その後、切開前に手術部位全体を徹底的に剃り、毛を完全に除去します。手術部位を2.5センチの点線で描き、最初の切開の長さを確認します。切開の上端は下唇から約1〜1.5センチ下に置きます。

足の指をつまむ反射で麻酔の深さを確認した後、マークされた線に沿って頸筋の浅層を慎重に切開します。その後、主に浅い頸筋膜を中心に残った筋肉層を優しく切り離し、頸動脈を露出させます。胸骨突起筋と下顎下腺を引っ込め、手術視野から離して頸リンパ管の特定を容易にします。

手術期間を維持するために組織拡張器を使いましょう。綿棒で筋肉組織を一時的に保持しながらリンパ節と関連するリンパ管の位置を探ります。頸動脈に平行に走る不透明で無色の頸部リンパ管を見つけてください。

鈍い鉗子を使い、分離した結合組織を優しく通り抜け、鉗子をその位置に保ちます。頸部リンパ管を周囲の結合組織や脂肪組織から鈍的解離で慎重に隔離してください。露出した血管の上半分に小さな切開を入れます。

手術窓から約1.5センチのところに小さな二次皮膚穿刺を設け、カニューレの追加固定点として作ることがあります。カニューレを2つ目の開口部から挿入し、鉗子で遠位端を掴み、面取り面が上向きになるようにします。次に、切開部から約2ミリメートルの遠位端をリンパ管内に優しく挿入し、頭部に向かって向きを調整します。

カニューレの近位端を1〜2分間観察してください。リンパ液のゆっくりと一定の流出を観察して、カニュレーションの成功を確認します。切開部と二次固定穴にピペットで少量のシアノアクリレート組織接着剤を塗布してカニューレを固定します。

リンパ流を数分間観察し、安定した流出を確認してください。その後、慎重に組織拡張器を取り外し、下顎下腺を元の位置に戻します。カニューレの遠位端に、あらかじめラベルが貼られた抗凝固剤コーティングされたマイクロ遠心分離機チューブを取り付けます。

その後、すべての筋肉層を元の位置に戻し、皮膚切開部を縫合糸や組織接着剤で閉じます。リンパを抗凝固剤被覆のマイクロ遠心分離機チューブに継続的に集め、通常は1時間ごとにチューブを交換します。採集期間中は必ずラットを麻酔状態に保ちましょう。

採取したサンプルは氷嚢と一緒にクーラーボックスに保管してください。成功裏にカニューレしたラットの6時間の採取期間における1時間あたりのリンパ流量は、0.09ミリリットルから0.13ミリリットル/時間の範囲でした。健康なラットでは、紋体体内投与のトリチウム標識アルブミンの累積リンパ輸送は最初の2時間は無視できる程度に抑えられ、その後は大幅に増加しました。

リンパ液と血漿のトリチウム標識アルブミン濃度の比較により、健康なラットでは時間とともに異なる濃度プロファイルが示されました。大腸菌リポ多糖の腹膜間投与による神経炎症は、8時間で全体のリンパ流量がわずかに減少し、リンパに輸送される総量の割合がほぼ2倍に減少したと関連していました。リンパと血漿の濃度比は健康なラットと神経炎症ラットの間で有意な差はなく、頸部リンパクリアランスのプロファイルが類似していることを示しました。

このプロトコルにより、脳由来リンパの直接生物学的サンプリングが可能となり、間接的な外部イメージングや樹脂法と測定可能な中枢神経系の流出を橋渡ししました。このプロトコルにより、リンパ経路を通じた中央投与の薬物クリアランスを研究し、排出経路やクリアランス率の測定が可能になります。今後の研究では、CNS疾患の状態がどのようにリンパのクリアランスを感知するかを調べ、この知見を用いて治療のために脳リンパ機能を回復させる薬剤の最適化に活用できるでしょう。