最小限の入力による乳児免疫マッピング:統合的単細胞および多組学プロファイリング

私たちの研究は、少量の血液量から縦断的に高次元マルチオミクスプロファイリングを用いて、出生後の初期免疫の適応を定義しています。このプロトコルは、健康、感染、炎症の限られた生体標本から新生児および小児の縦断的な免疫プロファイリングを行う研究に適用可能です。まず、溶けた乳児赤血球が入った小瓶を37度の水浴で素早く解凍します。

解凍した細胞を、温かい完全なRPMI培地10ミリリットル、37度の15ミリリットル円錐管に移します。チューブを400gで室温で5分間遠心分離し、上澄液を捨てます。細胞ペレットを3ミリリットルの完全なRPMI培地に再懸浮させ、細胞の総数を数えます。

濃度が高すぎて数えられない場合は試料を希釈してください。細胞数を数えた後、遠心分離を繰り返し、完全なRPMI培地に再懸浮させて1ミリリットルあたり100万細胞の濃度を得る。96ウェルのV型底板の各ウェルに、100マイクロリットルの100マイクロリットルを含む100ミリットルの細胞を移します。

プレートを764gで4度の温度で2分間遠心分離します。上清液は捨てる。次に、100マイクロリットルの生死染料ストックをPBSで1〜2,000希釈し、FCブロックと単球ブロックを1〜100に希釈したものを、未染色対照群を除くすべてのサンプルに加えます。

サンプルを4度で15分間培養します。細胞を洗浄するには、PBSを100マイクロリットル加えます。プレートを764gで4度Cで2分間遠心分離し、上澄液を慎重に捨てます。

未染色対照を除き、表面抗体カクテル100マイクロリットルを蛍光活性細胞選別(FACSバッファー)で希釈したものを100マイクロリットルに加えます。4度で30分間孵卵します。その後、細胞を100マイクロリットルのFACSバッファーで洗浄し、遠心分離機で洗浄し、上清液を廃棄します。

各サンプルに4%パラホルマルデヒドを100マイクロリットル加えて細胞を固定します。室温の暗い環境で15分間培養し、その後再度細胞を洗浄し、200マイクロリットルのFACSバッファーに再懸浮させます。UltraComp補正ビーズを単色コントロールとして準備してください。

単色コントロールビーズはサンプルと同じ手順で染色し、サンプルが固定されている場合は固定も含めて塗ります。また、蛍光を1つ引いたものやFMOコントロールも同様に準備してください。サンプル、単色対照、無染色対照、蛍光マイナス1制御を従来型またはスペクトル式フローサイトメーターで実行します。

FlowJoを開き、分析する対象のサンプルを選択します。適切なアイソタイプとFMOコントロールを使ってゲートを設定しましょう。FSCとSSCを用いてデブリを排除し、細胞のサイズと粒度で選択するゲート白血球。

FSCAとFSCHでダブルセットを除外する。生存性染料を使って死んだ細胞を除外するゲートを行います。生きた単細胞から、CD33陰性リンパ球とCD-33陽性骨髄細胞に分裂します。

CD33陽性細胞内で、CD14陽性単球を特定します。次にCD33陽性細胞内で、CD14陰性およびCD11C陽性の樹状細胞を特定します。現在、CD33陰性リンパ球のうち、歩行型CD3陽性T細胞とCD3陰性でCD56陽性の自然キラー細胞が存在します。

CD3陽性T細胞内では、CD8陽性およびCD4陽性のサブセットを特定し、CD3陰性、CD56陰性、CD19陽性のB細胞を特定します。まず、37度の水浴で凍結保存された赤血球溶解細胞のバイアルを解凍します。懸濁液を15ミリリットルの円錐形管に移し、T細胞培地10ミリリットル入り、遠心分離機で430g、4度Cで5分間投与します。

上清液は捨てる。細胞ペレットを1ミリリットルのPBSで再懸浮させた後、さらに9ミリリットルのPBSをサンプルに加えます。チューブを430gで4度Cで5分間遠心分離し、上澄液を捨てます。

トリパンブルー排除を用いて細胞数を数え、生存可能性を評価します。生存率が70%未満の場合は、以下の方法で死細胞除去キットを使用してください。まず、20倍結合バッファーのストック溶液を無菌二重蒸留水で希釈して1倍結合バッファーを準備します。

細胞ペレットを100マイクロリットルの死細胞除去マイクロビーズに再懸浮させ、合計7細胞の乗数に相当します。よく混ぜて室温で15分間孵育します。磁気分離カラムを適切な磁気スタンドに設置し、集水管も一緒に設置します。

その後、500マイクロリットルの1x結合バッファーでカラムを平衡させます。細胞懸濁液を500マイクロリットルにし、結合バッファーを1倍にします。収集チューブを交換した後、細胞懸濁液をカラムに適用し、新しい1.7ミリットルマイクロ遠心分離機チューブで流れを採取します。

次に、500マイクロリットルの結合バッファーでカラムを2回洗浄し、同じマイクロ遠心分離機管内で流れ液を収集します。300gでエリュートを遠心分離機で10分間過ごし、上清液は捨てます。細胞数を数え、トリパンブルー排除を用いて再度生存可能性を評価します。

20,000個の生存細胞を新しい1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離機チューブにアリコート。その後、細胞を300gで10分間遠心分離し、上清液を取り除きます。細胞を0.04%BSAを含むPBS40マイクロリットルで再懸浮させます。

最後に、細胞入りチューブを氷に置き、すぐにゲノムコア施設に送りライブラリーの生成とシーケンスを行います。シーケンス結果をセルレンジャー出力の形式で収集してください。早産児および対照群の乾燥した血斑サンプルを処理しました。

また、免疫関連タンパク質92の正規化タンパク質発現が定量化されました。リンパ球活性化遺伝子3およびシグナル閾値調節膜貫通アダプター1の発現は、生後2か月の早産児の末梢血において、正期臍帯血と比較して有意に高かった。赤血球溶解白血球サンプルから白血球集団を特定するために包括的なゲート戦略が用いられました。

T細胞集団内で、CD4陽性とCD8陽性のサブセットが区別されました。フィルタリング後、12万以上の細胞が捕捉され、単一細胞リボ核酸シーケンシングデータセットにプロファイリングされました。次元削減およびクラスタリング解析により、14の異なる細胞クラスターが特定されました。

細胞クラスターは、差異発現遺伝子と既知の細胞マーカーに基づいて注釈付けされました。14個のクラスターのうち12個は免疫細胞系統に対応しており、T細胞、自然キラー細胞、B細胞、骨髄細胞、好中球が含まれていました。積み重ね棒グラフは、生後1週間、1か月、2か月のクラスターあたりの細胞の割合を相対的に示しました。

本研究により、限量血液サンプルから細胞、トランスクリプト、プロテオーム、機能的免疫シグネチャーを縦断的に測定することが可能になります。今後の研究では、これらの手法を活用して健康な免疫経路を定義し、疾患に関連する初期免疫応答の調節不全を明らかにできるでしょう。