ナノディスク内の膜タンパク質を安定化する技術

このプロトコルは、生成された方法フレームワークを用いた再現可能なナノディスク再構成ワークフローを強調しています。洗剤は膜タンパク質を不安定化させます。MSPや脂質を含むナノディスクは、クライオEMや溶解のためのネイティブ構造を認識します。

まず、クロロホルムで調製した脂質成分をガラス試験管に加え、100マイクロリットルの脂質混合物を作って十分に混ぜます。クロロホルムを窒素ガスの穏やかな流れで蒸発させ、すべての液体が除去されるまで続けます。約2ミリリットルのn-ペンタンをガラス試験管に滴り加え、窒素ガスで溶媒を蒸発させて乾燥した透明な脂質膜を得る。

チューブのキャップを緩めた後、真空乾燥器に入れます。乾燥器を空にし、残留溶媒を除去するために真空状態で保温してください。その後、真空乾燥機から脂質膜を除去し、洗剤不使用かつ低塩分のバッファー250マイクロリットルを加えて脂質膜を水和させ、最終的な脂質濃度は10ミリグラム/ミリリットルとなります。

脂質を再懸浮させた後、4本のガラス管に均等に分けます。懸濁液を超音波処理し、透明でリポソーム形成が成功したことを示すまで処理します。その後、すぐに各チューブのヘッドスペースに窒素ガスを充填し、使用までマイナス80度で保存します。

MSP1D1プラスミドによる大腸菌BL21細胞の形質転換後、7ヒスチジンタグを付与し、その後の培養拡張。最終濃度0.5から1ミリモルにIPTGを加えることでMSP発現を誘導します。その後、16度の温度で16〜20時間、振って細胞を培養し続けます。

細菌培養液を4度の温度で10分間遠心分離します。上清液を捨て、細胞ペレットを残します。次に、1リットルの培養から得られたペレットを100〜150ミリリットルのリシスバッファーに再懸浮させます。

均一な懸液になり、塊が目立たないまで徹底的に均質化します。次に、冷蔵された超音波細胞破壊装置を使い、3秒間のパルスと6秒間の停止のサイクルで35%の出力で細菌を破壊します。分解液が透明で薄茶色になるまで超音波検査を続けます。

溶解液を30,000gで45分間、摂氏4度で遠心分離し、その後の工程のために上清液を採取します。上清液を平衡化されたニッケルNTA樹脂で培養し、不純物を除去して洗浄した後、標的タンパク質を洗脱バッファーで洗い出し、解出物の分画を収集します。280ナノメートルでの溶出液の吸収率が0.01を下回るまで、分画を収集し続けます。

その後、溜まったイリュートを透析チューブに移し、透析バッファーに4度の温度で一晩やさしくかき混ぜて透析します。透析後、超ろ過装置で溶液を濃縮し、最終MSP濃度を1ミリリットルあたり2〜5ミリグラムとします。約250ミリグラムのバイオビーズを50ミリリットルの遠心分離機管に重さを量ります。

チューブに25〜30ミリリットルのメタノールを加えます。暗闇の中で混合物をしっかり回転させたり、渦巻いたりします。チューブを4度Cで20分間培養した後、上澄液を慎重に捨て、メタノール洗浄をさらに2回繰り返します。

同様の洗浄を二重蒸留水で3回行い、その後ビーズに25〜30ミリリットルの洗剤不使用低塩バッファーを加えます。先ほど示したように、チューブを回転テーブルの上で振るまたは回転させて混合し、培養します。上清液を捨て、低塩バッファーの平衡工程を3回繰り返してビーズを完全に調整します。

活性化されたバイオビーズを1.5ミリットルのマイクロ遠心分離機チューブ3本に均等に分けて、さらに使用します。あらかじめ準備された脂質ストックを1アリコート取り出して解凍します。すぐにチューブを7,000gで4度の温度で5秒間遠心分離し、底部の内容物を回収します。

脂質ストックを60%振幅で水浴で超音波処理し、5〜10分ごとに透明度と温度を監視して過熱を防ぎます。脂質ストックが透明で透明になるまで超音波処理を続けます。提示された式を用いて標的膜タンパク質のモル量を計算します。

次に、標的タンパク質とMSPと脂質のモル単位比を基に、MSPおよび脂質溶液の必要な体積を、1から5から250のモル単位比で計算します。対応する脂質とMSPを組み合わせて300マイクロリットルのマスターミックスを準備し、氷上で10分間培養します。その後、濃縮タンパク質溶液に50マイクロリットルの混合物をゆっくり加えつつ、均一な質を保つために優しくピペットします。

その後、混合液を氷に1時間置き、15分ごとにチューブを優しく反転させてしっかりと混ぜます。次に、事前に活性化されたバイオビーズのアリコートを1つ取り、残留する低塩緩衝液を吸引します。タンパク質溶液をビーズに加え、暗闇で4度の温度で1時間回転して培養します。

混合液を7,000gで4度の温度で5秒間遠心分離します。上澄液を低塩緩衝液を吸引した2つ目のバイオビーズに慎重に移します。優しく逆転してよく混ぜた後、暗闇で4〜8時間または一晩孵化します。

タンパク質溶液を短時間遠心分離したら、上清液を事前に活性化されたバイオビーズの第3アリコートに移します。暗闇の中、4度Cで回転させて1時間孵化します。短い遠心分離の後、上清液を清潔なマイクロ遠心分離機チューブに移します。

17,000g、4度Cで10分間遠心分離機で骨材を除去します。ナノディスクTASK2複合体をサイズ排除クロマトグラフィーで精製した後、エクストレーションのピーク分画をプールし、最終的なナノディスクTASK2濃度1.2〜1.5ミリグラム/ミリリットルに濃縮します。ナノディスクアセンブリを検証するために、12%SDS-PAGを用いてサンプルを解析し、MSPおよびターゲット膜タンパク質の存在を確認します。

サイズ排除クロマトグラフィープロファイルでは、組み立てナノディスク複合体に対応する15.1ミリリットルの主要なピークと遊離MSPの18.0ミリリットルに対応する2つのピークが示されました。ピーク面積の定量化により、組み立てられたナノディスクのピーク面積は147.2であることが示されました。対照的に、遊離MSPピークの面積は31.5で、組み立て効率は82.4%に相当します。SDS-PAGEにおける標的タンパク質とMSPの共移動により、それらが単一のナノディスク複合体に組み込まれていることが確認されました。

このプロトコルは、ナノディスクアレイ構成を用いて膜タンパク質構造を研究者が研究するのに役立ちます。最も難しいのは、膜タンパク質、MSP、脂質の比率を最適化することです。機能分析、表面プラズモン共鳴、質量分析もこの手法で実施可能です。