自己組織化ヒト心型心肌における低酸素再酸素損傷モデル
March 17th, 2026
自己組織化型ヒト心臓オルガノイド(hCOs)は、ヒトの心臓発生や疾患をモデル化するための新興システムです。ここでは、低酸素再酸素化によるhCOの生成および損傷の方法論と、損傷後の予想される組織学的および機能的転帰の詳細を提供します。
私たちの研究は、損傷後の心臓再生を助ける新しい方法を見つけることに焦点を当てています。そのために、自己組織化する心臓オルガノイドを生成し、低酸素再酸素化研究を行います。このプロトコルは、損傷反応の研究、再生を促進する治療的介入、患者特異的な疾患モデリングにも応用可能です。
まず、D1心臓中胚葉指定培地を吸引し、ヒト誘導の多能性幹細胞由来心臓中胚葉細胞を完全に覆うほどの細胞剥離液を添加します。次に、皿を37度のインキュベーターに5分間置きます。ピペットを使い、各ウェルに同量のD2心臓中胚葉培地を加え、優しく上下にピペットして付着細胞を解放し、細胞懸濁液を15ミリリットルの円錐形管に移します。
遠心分離機を使って、室温で300Gの細胞を3分間ペレットします。ペレットを5マイクロモルIWP-2およびRBマイナスでアスコルビン酸50マイクログラム/ミリリットルを含むD2心臓中胚葉仕様培地1ミリリットルに再懸浮させます。トリパンブルー10マイクロリットルと細胞懸濁液10マイクロリットルをマイクロチューブで混ぜます。
推奨されるカウント方法で細胞数を数え、D2心臓中胚葉指定培地に2マイクロモラルチアゾビビンを補足して、細胞を1ミリリットルあたり100,000個の濃度まで希釈します。セルの懸濁液を適切なサイズの試薬リザーバーに移します。その後、マルチチャネルピペットを用いて、超低接着型96ウェルプレートの各ウェルに100マイクロリットルを注入し、最終濃度は1ウェルあたり10,000個となります。
500Gで室温で5分間回し、懸濁培養中にヒト心臓オルガノイド形成を誘導します。各井戸に大きく、よく囲まれた細胞ペレットが形成される様子を観察してください。ペレットが制限されていない場合は、遠心分離を繰り返します。
24時間後、5マイクロモルIWP-2および50マイクログラム/ミリリットルのアスコルビン酸(RB-1/プレート)を含むD3培地10ミリリットルを準備します。マルチチャネルピペットを使い、既存の媒体を除去せずに各ウェルに100マイクロリットルのD3メディアを追加します。翌日、各ウェルから100マイクロリットルのD3培地を除去します。
吸引リスクを最小限に抑えるために、プレートを45度傾け、マルチチャンネルピペットをプレート側壁に対して90度の角度で保持してください。ピペットを井戸の壁にしっかり置き、ゆっくりと吸引します。培地を除去した後、RBマイナスで5マイクロモルIWP-2を含むD4培地100マイクロリットルに置き換えます。
先端を切り落とした1,000マイクロリットルのピペットを使い、ヒト心臓オルガノイドを1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離機管に移します。オルガノイドがチューブの底まで沈み、余分な培地を優しく取り除きます。オルガノイドを一度洗浄するためにリン酸塩緩衝生理食塩水を加えます。
数秒待って沈み、余分なPBSを優しく取り除いてください。次に、4%のパラホルムアルデヒドを加えてオルガノイドを固定し、チューブを室温で30分間固定させます。次に、1.7ミリリットルのマイクロ遠心分離管に所定数の固定オルガノイドを移します。
固定液を除去し、0.1%のPBSでオルガノイドを洗い、Tween 20を含みます。一次抗体溶液を染色液で所望の濃度に希釈して準備します。ピペットを使い、各マイクロ遠心分離機管に一次抗体溶液を50〜100マイクロリットル加え、オルガノイドが完全に覆われるようにします。
培養後、染色液で希釈した二次抗体と共に、振動台の上で4度Cで24時間培養します。孵化後は、前述の洗浄を行います。次に、切断したピペットの先端を使ってオルガノイドを正に帯電したガラススライドに移します。
Tween 20で余分なPBSを優しく除去し、オルガノイドを覆うために数滴のマウンティングメディアを加えます。オルガノイドの上にカバースリップを慎重にかけて平らにします。その後、蛍光顕微鏡検査を行います。
固定オルガノイドを30%ショ糖で4度Cで一晩培養した後、プラスチック型に移し、最適な切削温度の化合物を少量加え、オルガノイドを覆う程度に加えます。細いピンセットやピペットの先端を使って、オルガノイドをコンパウンド内で優しく位置を変え、型の端から固まらないようにします。オルガノイドは型の底にできるだけ近づけて、単一のクライオセクションで最大限の数を増やします。
型をドライアイスの層を敷いた発泡スチロールのクーラーに入れ、最適な切断温度の初期層を凍結します。コンパウンドが硬化するまで数分待ってから、型を作業台に移します。最適な切削温度の化合物を追加して型が満たされるまで加えます。
最初の層が完全に溶けるまで待ってから、型をドライアイスに戻して完全に凍結させます。凍結後は、型をマイナス80度で保存するか、6マイクロメートルの断片を得るためにクリオセクションに進みます。ピペットを使い、96ウェルのヒト心臓オルガノイドプレートあたり5ミリリットルの低酸素培地を細胞培養フラスコに移します。
フラスコを低酸素室に入れ、5%二酸化炭素と95%窒素からなる無酸素ガスで3分間洗浄します。低酸素状態を開始する前に、チャンバーを37度のインキュベーターに少なくとも1時間置いてください。マルチチャネルピペットを用いて、ヒト心臓オルガノイドプレートのすべてのウェルから約150マイクロリットルの培地を除去します。
その後、200マイクロリットルのピペットを使い、オルガノイドを乱さずに各ウェルから残りの培地を慎重に取り出します。各ウェルに50マイクロリットルの低酸素培地を加えます。人間の心臓オルガノイドプレートを低酸素室に入れます。
そして、5%二酸化炭素と95%窒素からなる無酸素ガスでチャンバーを3分間洗浄します。低酸素室を37度のインキュベーターに6時間入れます。再酸素化を開始するには、低酸素室から人間の心臓オルガノイドを取り出します。
マルチチャネルピペットを使い、各ウェルに150マイクロリットルの予備加熱済みRB+メディアを加えます。最後に、プレートを37度のインキュベーターに入れ、下流のアッセイを行う前に少なくとも3時間の再酸素化を行います。6時間の低酸素状態と24時間の再灌流後、損傷したヒト心臓オルガノイドの細胞外乳酸脱水素酵素活性が無損傷対照群と比較して有意に増加しました。
低酸素処理を受けた心臓オルガノイドはTUNEL陽性心筋細胞核を示し、損傷したオルガノイドではTUNEL陽性心筋細胞核の割合が損傷していない対照群に比べて有意に多かった。再酸素化前の低酸素状態の時間が長くなるにつれて瘢痕形成が時間依存的に増加することが観察されました。再灌流後24時間時点で、損傷していないヒト心臓オルガノイドの69%が打動しており、損傷したオルガノイドは一切打動していませんでした。
損傷のないヒト心臓オルガノイドは、5つの関心領域で同期したカルシウム過渡現象を示し、ピークは同時期かつ類似した波形で現れました。損傷したヒト心臓オルガノイドは協調した収縮を示さず、関心領域全体で不規則な自発的なカルシウム過渡期を示しました。このプロトコルにより、研究者はiPSC由来のヒト心臓オルガノイドにおける心筋梗塞を模倣することが可能になります。
再現可能な損傷を確保する上で最大の技術的課題は、既存のメディアを完全に除去することです。今後の研究は、ヒト心臓オルガノイドモデルにおける組織再生を促進する要因を特定することを目指しています。
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This protocol details the generation, maintenance, and injury modeling of human induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived cardiac organoids (hCOs). It provides a step-by-step guide for creating self-assembling hCOs, inducing hypoxia-reoxygenation injury to mimic ischemia/reperfusion, and performing histological and functional analyses. The approach enables researchers to study cardiac injury responses and test therapeutic interventions in a human tissue context.
Key Study Components
Area of Science
- Cardiac biology
- Stem cell research
- Organoid technology
- Ischemia-reperfusion injury modeling
Background
- Ischemic heart disease can cause irreversible cardiomyocyte loss and impaired cardiac function if not rapidly treated.
- There is a need for human tissue models to study hypoxia-reoxygenation injury and evaluate therapies.
- Human cardiac organoids (hCOs) offer a promising model but present technical challenges due to their small size and culture requirements.
- Existing animal models do not fully recapitulate human cardiac injury and regeneration.
Purpose of Study
- To provide a user-friendly protocol for generating and maintaining iPSC-derived hCOs.
- To establish a reproducible method for inducing hypoxia-reoxygenation injury in hCOs.
- To enable histological and functional analysis of injury and recovery in human cardiac tissue models.
Methods Used
- Differentiation of human iPSCs into cardiac mesoderm and formation of self-assembling organoids in ultra-low attachment plates.
- Suspension culture and stepwise media changes to promote cardiac organoid maturation.
- Fixation, immunostaining, and cryosectioning for histological analysis.
- Induction of hypoxia-reoxygenation injury using a hypoxia chamber and controlled gas environment.
- Assessment of injury via lactate dehydrogenase release, TUNEL staining, contractility, and calcium imaging.
Main Results
- Hypoxia-reoxygenation injury in hCOs led to increased extracellular lactate dehydrogenase activity, indicating cell damage.
- Injured organoids showed a higher percentage of TUNEL-positive cardiomyocyte nuclei, reflecting increased apoptosis.
- Scar formation increased with longer hypoxia duration before reoxygenation.
- Beating activity and synchronized calcium transients were lost in injured organoids, while uninjured controls maintained coordinated contractions.
Conclusions
- This protocol enables reproducible modeling of myocardial infarction-like injury in human cardiac organoids.
- It provides a platform for studying injury responses and testing regenerative therapies in a human context.
- Future work will focus on identifying factors that promote tissue regeneration using this model.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Modeling hypoxia-reoxygenation injury in self-assembling human cardiac organoids enables predictive interrogation of human myocardial injury and recovery mechanisms. This system provides a translationally relevant platform for evaluating therapeutic interventions and de-risking targets in ischemic heart disease. The approach supports early-stage portfolio decisions by bridging the gap between in vitro discovery and preclinical validation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of cardiomyocyte injury and regeneration pathways in a human context.
- Supports functional target validation by quantifying apoptosis, scar formation, and contractility loss after injury.
- Facilitates predictive confidence in candidate targets by modeling clinically relevant injury phenotypes.
Screening & Assay Development
- Provides a reproducible, scalable platform for compound screening in human cardiac tissue models.
- Delivers quantitative outputs such as lactate dehydrogenase release and TUNEL positivity for assay standardization.
- Enables assessment of synchronized calcium transients and contractility for functional screening endpoints.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant human myocardial injury, supporting translational biomarker development.
- Offers continuity from discovery through preclinical validation by complementing animal models.
- De-risks advancement decisions by providing human-specific injury and recovery data.
Pipeline & Workflow Integration
This model integrates into the discovery-to-preclinical continuum, enabling hypothesis testing, target validation, and translational assessment of cardiac injury interventions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven testing of regenerative and protective factors in human cardiac tissue.
- Screening: Provides standardized, quantitative injury readouts for compound evaluation.
- Analytics: Enables statistical comparison of injury markers and functional outputs across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with preclinical and clinical relevance in ischemic heart disease.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse cardiac injury and regeneration studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in cardiac injury research.
- Operational Value: Standardizes injury modeling and readouts for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions and optimizes resource allocation in early cardiac portfolio programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of regenerative and protective cardiac therapies.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, cardiac differentiation, and organoid handling.
- Needs access to hypoxia chambers, fluorescence microscopy, and quantitative assay platforms.
- Demands rigorous cross-team standardization for reproducible injury induction and analysis.
- Adaptation across iPSC lines and disease models may require protocol optimization.
- Technical reproducibility hinges on precise media removal and injury timing.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:22
Differentiation of iPSC Derived Cardiac Mesoderm Cells to Human Cardiac Organoids (hCOs)
3:31
Fixation and Whole-Mount Immunostaining of Human Cardiac Organoids
5:37
Embedding the Cardiac Organoids for Cryosectioning
6:55
Inducing Hypoxia-Reoxygenation Injury in Human Cardiac Organoids
8:53
Results
10:13
Conclusion
