鯨類モニタリングのためのホエールウォッチング船からの環境DNAサンプリング

このプロトコルは、クジラ観察クルーズ中のクジラeDNAサンプリングの標準化されたアプローチを提供します。多様なeDNAサンプリング方法が利用可能です。これは比較データ分析を妨げます。

当社のプロトコルは環境条件に最適化され、汚染防止の対策を講じています。eDNA無線研究所の支援を受けて、このプロトコルは専門家でない人や市民科学者によって、ホエールウォッチング活動中や世界中で実施可能です。まず、フィールドデータシートや鯨類環境DNAサンプリングのためのラミネートされたステップバイステップのフィールドプロトコルを含む現地記録資料を準備してください。

防水マーカー、フルークプリントごとにeDNAフィルター2個、十分な数の手袋、専用の廃棄物容器を箱に入れてください。船舶の種類や船内構成に適した1つ以上の硬質バケツ、二次的な環境DNA容器、携帯型の蠕動水ポンプまたは真空ポンプを準備します。機材を扱う際は手袋を着用し、作業間には手袋を交換してください。

機器を滅菌するには、バケツ、蓋、容器、ポンプチューブのすべての表面に均等に薄めた家庭用漂白剤を塗布してください。水道水で3回しっかりすすいでください。乗客到着前にすべての資材を機内に持ち込み、指定された清潔な場所に保管してください。

船のサンプリングのタイミングと船の位置調整を船員と連携させること。水面上の浮上パターンを観察し、クジラのダイブを予測しましょう。吸い足跡からできるだけ早く20リットルの海水を集め、潜水後10分以内の遅延を最小限に保ちましょう。

各地域から、各場所や船舶の種類に適したカスタマイズされた物流条件を用いてサンプルを採取します。必要に応じて、集めた水を船内の指定されたろ過ステーションに運び、流出を防ぎます。種の同定、地理的定位システムの座標、時間、サンプルの再現同定をデータシートに記録してください。

ろ過前に手袋を交換しましょう。フィルターバッグを開けて、フィルターを出口のそばだけに触れてください。吸気口をスノーケルに差し込み、ポンプのチューブを出口に接続します。

フィルターハウジングを水に浸さずにシュノーケルを水サンプルに浸し、ポンプを速く安定した流量に設定します。流量の安定性を監視しながら、10リットルを連続してろ過してください。次にフィルターを逆さまにして、ポンプを30〜60秒間運転して残留水を除去します。

現場の状況に応じてろ過ポンプのセットアップをカスタマイズしてください。ポンプの電源を切り、チューブを外してください。フィルターを元の袋に入れ、すぐにラベルを貼ってください。

手袋を交換し、2回目の複製のためにろ過の準備をしてください。自己保存型の環境DNAフィルターは、安全で乾燥した容器の中、日陰の環境温度のある部屋に保管してください。周囲温度が20度を超えた場合はフィルターを冷蔵し、3か月以内に発送してください。

すべての検査手順は、十分な換気が確保された専用の紫外線滅菌室で実施してください。DNAフリーの手袋と防護服を着用した後、作業台を徹底的に清掃してください。DNAフリーの鉗子を使い、フィルター膜を三角形に折りたたみ、先端を下向きにした2ミリリットルの反応管に移します。

各反応チューブに380マイクロリットルのTESバッファーと20マイクロリットルのプロテナーゼKからなる400マイクロリットルの溶解バッファーを加えます。短時間渦巻き、56度Cで少なくとも3時間攪拌しながら孵化します。フィルターを底に穴あきのプラスチック入口に入れ、室温で18,626Gの遠心分離機で10分間、溶解バッファーとフィルターを分離します。

ピペットで抽出試薬をウォッシュプレートや洗脱プレートに投入します。総溶解液量が300マイクロリットルを超える場合は複数の結合プレートを使用してください。渦巻き磁気粒子を使い、最初の結合板に1井戸あたり30マイクロリットルを加えます。

2つの結合プレートの予備DNA取り込みプログラムを実行し、その後のDNA抽出プログラムをロボットで実行してください。すべてのQPCR反応を三つにまとめて実行するには、専用の作業スペースで必要なマスターミックスを準備し、ウェル全体に分散させます。各ウェルにターゲットDNA標準またはeDNA抽出物を3マイクロリットル追加します。

準備済みPCRプレートを密封した後、3、500Gで10秒間遠心分離し、プレートをリアルタイム定量PCRサーモサイクルラーに入れます。最後に、最適なサイクル条件でアッセイを実行します。アイスランドのスキャルファンディ湾およびアゾレス諸島で247点の環境DNAまたはeDNAサンプルが採取され、1枚のフルークプリントにつき最大10リットルの海水を2つの自己保存型eDNAフィルターで採取しました。

ザトウクジラのeDNAを解析した44のeDNAフィルターのうち、20は増幅シグナルを示し、24は増幅が認められませんでした。抽出ブランク、フィールドコントロール、定量PCR対照では検出可能な増幅がなく、汚染がないことを示しました。陽性反応のうち、9つのeDNAフィルターは検出限界より少なくとも1つのサイクル閾値以下で検出され、信頼できる検出として分類されました。

残りの11個のEDNAフィルターは検出限界を超えるサイクル閾値を生成し、検出が妥当であることを示しました。平均サイクル閾値はアゾレス諸島のeDNAフィルターで約34.7とわずかに低く、アイスランドのフィルターは約36.9でした。アゾレスとアイスランドのeDNAフィルター間のサイクル閾値値の差は統計的に有意ではありませんでした。

このプロトコルは、将来の大規模なeDNAサンプリングキャンペーンで海洋生物多様性やクジラ個体群遺伝学を調査する際に活用される可能性があります。このプロトコルにより、鯨類および共存する分類群を非侵襲的に検出・監視することが可能です。これはホエールウォッチング船から採取された吸虫の指紋に含まれるeDNAによるものです。