Name: CAR T細胞の機能プロファイリングのためのビーズベース多重性フローサイトメトリーアッセイ (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2026-07-10T12:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 31 s
Description: 学ぶ ビーズベース多重性フローサイトメトリーアッセイを用いてCAR T細胞の機能プロファイリングを行う方法。IFN-γ、IL-2、TNF-α、グランザイムBなどのエフェクター分子を同時検出し、限られたサンプルから多パラメータ定量分析が可能です。

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<ol><li>Biery, D. N., Turicek, D. P., Diorio, C., Schroeder, B. A., Shah, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Need+for+standardization+of+cytokine+profiling+in+CAR+T+cell+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Need for standardization of cytokine profiling in CAR T cell therapy.</a> Mol Ther. 32 (9), 2979-2983 (2024).</li>
<li>Boulch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cross-talk+between+CAR+T+cell+subsets+and+the+tumor+microenvironment+is+essential+for+sustained+cytotoxic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Immunol%22%5BJournal%5D)">A cross-talk between CAR T cell subsets and the tumor microenvironment is essential for sustained cytotoxic activity.</a> Sci Immunol. 6 (57), eabd4344(2021).</li>
<li>Teachey, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+predictive+biomarkers+for+cytokine+release+syndrome+after+chimeric+antigen+receptor+T-cell+therapy+for+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Identification of predictive biomarkers for cytokine release syndrome after chimeric antigen receptor T-cell therapy for acute lymphoblastic leukemia.</a> Cancer Discov. 6 (6), 664-679 (2016).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytokines%3A+From+clinical+significance+to+quantification%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Cytokines: From clinical significance to quantification.</a> Adv Sci. 8 (15), 2004433(2021).</li>
<li>Leng, S. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+and+multiplex+technologies+for+cytokine+measurement+in+inflammation+and+aging+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">ELISA and multiplex technologies for cytokine measurement in inflammation and aging research.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 63 (8), 879-884 (2008).</li>
<li>Tighe, P. J., Ryder, R. R., Todd, I., Fairclough, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ELISA+in+the+multiplex+era%3A+Potentials+and+pitfalls%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">ELISA in the multiplex era: Potentials and pitfalls.</a> Proteomics Clin Appl. 9 (3–4), 406-422 (2015).</li>
<li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+targets%3A+a+versatile+cell%E2%80%91free+platform+to+characterize+CAR+T+cell+function+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Artificial targets: a versatile cell‑free platform to characterize CAR T cell function in vitro.</a> Front Immunol. 15, 1254162(2024).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+co%E2%80%91culture+model+with+CAR%E2%80%91T+cells%2C+antigen%E2%80%91presenting+cells%2C+and+tumor+cells+to+evaluate+CAR%E2%80%91T+cell%E2%80%91induced+cytokine+release+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">An in vitro co‑culture model with CAR‑T cells, antigen‑presenting cells, and tumor cells to evaluate CAR‑T cell‑induced cytokine release syndrome.</a> Front Cell Infect Microbiol. 16, 1721114(2026).</li>
<li>Lock, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated%2C+scaled%2C+transposon-based+production+of+CAR+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunother+Cancer%22%5BJournal%5D)">Automated, scaled, transposon-based production of CAR T cells.</a> J Immunother Cancer. 10 (9), e005189(2022).</li>
<li>Bethke, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+fully+human+FOLR1-targeting+CAR+T+cells+for+the+treatment+of+ovarian+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of fully human FOLR1-targeting CAR T cells for the treatment of ovarian cancer.</a> Cells. 13 (22), 1880(2024).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>MACSPlex Cytotoxic T/NK Cell Kit, human</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-125-800</td><td>フローサイトメトリー用のビードベースのマルチプレックスサイトカインアッセイ</td></tr><tr><td>MACSPlex InspectoR Tool</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>MACSPlexデータの自動ゲーティングおよび分析のためのウェブベースツール</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-343</td><td>マルチプレックスデータ測定のフローサイトメトリー機器</td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 16 Flow Cytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-803</td><td>マルチプレックスデータ測定のフローサイトメトリー機器</td></tr><tr><td>MACSQuant Express Mode</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>\</td><td>自動ゲーティングと分析のためのソフトウェア</td></tr><tr><td>TexMACS Medium</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-097-196</td><td>ヒトおよびマウスのT細胞の培養と増殖のために開発された最適化された無血清培養液</td></tr></tbody></table>

car t細胞の機能プロファイリングのためのビーズベース多重性フローサイトメトリーアッセイ

Bead-Based Multiplex Flow Cytometry Assay for Functional Profiling of CAR T Cells

CAR T細胞の機能プロファイリングのためのビーズベース多重性フローサイトメトリーアッセイ

Profiling CAR T cells presents challenges due to their heterogeneity, complex immune responses, and limited sample availability. Multiplex assays enable ...

私たちの研究はCAR T細胞の機能特性評価に重点を置いており、エフェクター分子の分泌をプロファイリングするためのフローサイトメトリー互換マルチプレックスアッセイを開発しました。本手順は、機能特性評価、メカニズム解析、品質管理（QC）試験、および力価評価などのCAR T細胞研究に適用することが可能です。まず、標的抗原を発現している、または発現していない標的細胞に対し、エフェクター細胞と標的細胞の比率を2.5:1として、作製したヒトキメラ抗原受容体T細胞（CAR T細胞）の共培養を準備します。分泌されるサイトカインを分析するか、または規定の時間枠内でサイトカインのキネティクスをモニタリングするために、上清を回収する1つまたは複数のタイムポイントを設定します。ペレットに200 µLのバッファーまたは細胞培養培地を加えて分析物標準品を再構成し、穏やかに混合します。6本の試薬チューブを用意し、再構成した標準品を3.2 pg/mLまたは0.6 pg/mLまで1対5の連続希釈系列で調製します。ブランクサンプルを調製します。共培養後、規定の時間に共培養物を21 °Cで300 g、5分間遠心分離します。上清をそのまま使用するか、標準曲線の範囲に収まるように希釈して使用します。MACSPlexフィルタープレートの各ウェルに200 µLのMACSPlexバッファーを加えてプレウェットし、バキュームマニホールドまたは遠心分離機を用いてウェル内が空になるまで吸引します。キャプチャービーズミックスをボルテックスし、ビーズを完全に再懸濁させます。96ウェルフィルタープレートの各ウェルに、50 µLの標準物質またはサンプルと、20 µLの希釈済みビーズを加えます。プレートを室温、暗所にて450 rpmで振盪しながら2時間インキュベートします。バキュームマニホールドを用いて、200 µLのバッファーでウェルを2回洗浄します。1:50に希釈した検出試薬1を100 µLずつウェルに加えます。室温、暗所にて450 rpmで振盪しながら1時間インキュベートします。ウェルを2回洗浄します。1:50に希釈した検出試薬2を100 µLずつウェルに加えます。室温、暗所にて450 rpmで振盪しながら30分間インキュベートします。ウェルを1回洗浄し、200 µLのバッファーでサンプルを再懸濁します。キャプチャービーズバイアルの2Dバーコードを使用して、MACSQuantフローサイトメーターに取得設定をロードします。ソフトウェアにログイン後、サンプルラックとしてMACSPlexフィルタープレートを選択します。ツールバーのBarcodeボタンをクリックして、2Dコードリーダーを起動します。バイアルのバーコードを点滅するライトに向け、0.5から2.5 cmの距離でリーダーに提示します。Autolabelタブで、Capture BeadsにMPx human cytotoxic T, and natural killer cellを割り当て、Nolabelを選択します。細胞傷害性T細胞およびナチュラルキラー細胞標準物質の連続希釈のグループ位置を定義します。Settingsタブで、Express Modeを選択します。typeをAnalysisに、modeをMACSPlex_Standardに設定します。その後、緩やかなミキシングを適用します。未知試料についても同様に割り当て、その位置を定義します。オプションで、試料をグループ化し、試料識別子と説明を入力します。Settingsタブで、再度Express Modeを選択します。typeをAnalysisに、modeをMACSPlex_Sampleに設定します。実験テーブルで、ラックの定義が正しいことを確認します。フィルタープレートのウェル内の液量を確認し、測定を開始します。青色および赤色レーザーを搭載したフローサイトメーターを用い、phycoerythrin（PE）、fluorescein isothiocyanate（FITC）、およびallophycocyanin（APC）チャネルでデータを取得します。MACSQuantフローサイトメーターにおいて、自動ゲーティングおよびデータ解析にExpress Modeテンプレートが使用されていることを確認します。あるいは、FSCまたはMQDデータファイルをウェブベースのInspectoRツールにアップロードし、自動定量サイトカイン測定を行い、エクスポート可能な結果を得ます。FITC対PEチャネルにおいて、12種類の異なるキャプチャービーズ集団が適切に分離していることを確認します。標準曲線を用いてサイトカイン濃度を算出します。最後に、結果をエクスポートして可視化します。マルチプレックスビーズエンコーディングを用いることで、個々の分析物を表す異なるビーズクラスターがバイアキシアルプロットにおいて明確に分離されました。腫瘍標的細胞との共培養後、CAR T細胞は高レベルのgranzyme B、interferon gamma（IFN-gamma）、tumor necrosis factor alpha（TNF-alpha）、およびgranulocyte macrophage colony-stimulating factor（GM-CSF）を分泌し、強力な活性化と細胞毒性エフェクター機能が示されました。Interleukin-2（IL-2）レベルは検出上限を超えており、これは強力な増殖シグナルと一致しています。IL-6、IL-10、IL-17A、IL-21、およびmonocyte chemoattractant protein 1（MCP-1）を含む、調節性T細胞または代替ヘルパーT細胞応答に関連するサイトカインは、低レベルまたは検出限界に近いレベルで存在していました。CAR T細胞は、抗原陽性標的を認識すると迅速かつ強力なサイトカイン放出を示し、8時間から24時間以内にgranzyme B、IFN-gamma、TNF-alpha、GM-CSF、およびIL-2が強くアップレギュレートされ、48時間までにピークレベルに達しました。また、IL-6、IL-17A、IL-21、およびperforinの緩やかな増加も観察されました。IL-4、IL-10、およびMCP-1は低レベルのままか、わずかに上昇しました。抗原陰性標的との共培養では、すべての分析物においてサイトカインの誘導は最小限でした。本プロトコルでは、CAR T細胞の活性化およびエフェクター機能を反映するサイトカイン、ケモカイン、および細胞毒性メディエーターの定量が可能です。本プロトコルにおいて最も重要な考慮事項は、共培養時間、エフェクター対ターゲット比、サンプルの希釈、および分析物を定量可能なレベルに維持することです。本手順に続き、上清のプロファイリングをフローサイトメトリーによるCAR T細胞の表現型解析や細胞毒性アッセイと組み合わせて実施することができます。

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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トランスレーショナルリサーチのためのハイスループット自動マルチプレックス免疫蛍光アッセイ(英語)

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Tregsのは、免疫系の強力な抑制因子である。それ故に、それらを定義するためにユニークな表面マーカーの欠如が存在する、Tregsのの定義は、主に機能的です。ここでは、最適化を説明...

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